신생아 대장균 균 혈증 분리물의 장 트랜스사이토시스 평가
Summary
대장균은 출생 무렵에 박테리아를 섭취하는 신생아에게 패혈증을 일으킵니다. 대장균이 장내에서 혈류로 이동하는 능력과 관련된 과정은 잘 이해되지 않았습니다. 이 시험관 내 모델은 대장균 균주가 장 상피 세포를 통해 이동하는 능력을 평가합니다.
Abstract
신생아는 분만 시기에 장을 식민지화하는 모체 대장균 균주를 섭취합니다. 장을 가로질러 전위할 수 있는 능력을 가진 대장균 균주는 신생아의 혈류를 침범하여 생명을 위협하는 균혈증을 유발합니다. 여기에 제시된 방법론은 반투과성 삽입물에서 성장한 편광 장 상피 세포를 활용하여 시험관 내에서 분리된 신생아 대장균 균혈증의 트랜스사이토시스를 평가합니다. 이 방법은 합류하여 성장하여 단단한 접합부와 데스모좀을 형성하는 능력을 가진 확립된 T84 장 세포주를 사용합니다. 합류점에 도달한 후 성숙한 T84 단층은 전압계를 사용하여 정량화할 수 있는 경상피 저항(TEER)을 발생시킵니다. TEER 값은 장 단층에 걸쳐 박테리아를 포함한 세포 외 성분의 세포 외 투과성과 반비례 관계가 있습니다. 반면에 박테리아의 세포 횡단 통과 (transcytosis)는 반드시 TEER 측정을 변경하지는 않습니다. 이 모델에서는 감염 후 최대 6시간 동안 장 단층을 가로지르는 박테리아 통과를 정량화하고 TEER을 반복적으로 측정하여 세포 투과성을 모니터링합니다. 또한, 이 방법은 분극화된 상피를 가로지르는 박테리아 트랜스사이토시스 동안 단단한 접합부 및 기타 세포 간 접착 단백질의 구조적 변화를 연구하기 위해 면역염색과 같은 기술의 사용을 용이하게 합니다. 이 모델의 사용은 신생아 대장균이 장 상피를 가로 질러 트랜스 사이토 화하여 균혈증을 생성하는 메커니즘의 특성화에 기여합니다.
Introduction
대장균은 신생아에서 조기 발병 패혈증의 가장 흔한 원인입니다 1,2,3. 신생아 대장균 균혈증의 사망률은 40 %에 달할 수 있으며 수막염은 심각한 신경 발달 장애와 관련된 가능한 합병증입니다2. 신생아가 모체 대장균 균주를 섭취하면 신생아 균혈증이 발생할 수 있습니다. 이 과정은 동물 모델 2,4에서 복제되었습니다. 일단 섭취되면 병원성 박테리아는 신생아 장 내강에서 장 장벽을 넘어 혈류로 들어가 패혈증을 유발합니다. 균혈증을 생성하는 신생아 침습성 대장균 균주는 장 상피 세포를 침범하는 능력이 다양합니다 1,5. 그러나 침범 후 장 상피를 트랜스사이토이스하는 능력은 완전히 특성화되지 않았습니다.
이 장 트랜스사이토시스 모델은 장 상피를 가로지르는 박테리아 통로를 모방하기 위한 유용한 시험관내 방법이다. 이 원고에 제시된 방법의 전반적인 목표는 신생아 대장균 분리 물이 장 상피를 트랜스사이토 스하는 능력을 비교하는 것입니다. 여기에 설명된 모델은 불멸화된 인간 장 선암 세포(6,7)인 T84 세포를 이용한다. T84 세포는 두 개의 개별 구획이있는 반투막에서 합류하도록 성장합니다. 이 기술을 사용하는 이유는 생체 내에서 발생하는 것처럼 이러한 장 세포가 분극화되어 성숙한 단단한 접합부 6,8을 개발한다는 것입니다. 멤브레인과 접촉하는 쪽이 기저면이됩니다. 세포의 반대쪽은 섭취 한 병원체가 부착되어 침입하는 장 내강과 유사한 정점면이됩니다. 트랜스웰 막은 박테리아에 투과할 수 있지만 분극화된 장 세포는 단단한 접합부를 형성하여 박테리아 초세포 이동을 손상시킵니다9. 따라서, 이 방법은 세포횡단 경로를 포함하는 박테리아 트랜스사이토시스의 과정을 연구하기 위해 인간 세포주를 활용하는 제어된 시험관내 환경의 이점을 제공한다. 장 상피를 가로지르는 박테리아의 트랜스사이토시스를 조사하기 위한 다른 방법이 존재하지만, 여기에 제시된 트랜스웰 방법은 더 큰 용이성과 접근성을 제공합니다. Ussing 챔버 시스템에 설정된 생체 외 샘플을 활용하는 것과 같은 대체 기술을 사용할 수 있습니다. 그러나 그들은 특히 연구가 인간 생리학을 연구하려는 경우 쉽게 접근할 수 없는 조직 표본을 활용합니다10. 장내 오가노이드는 숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 시험관내 대안의 또 다른 예를 나타냅니다11. 오가노이드 단층은 박테리아 트랜스사이토시스를 연구하기 위해 트랜스웰 시스템에서도 사용할 수 있지만 줄기 세포의 분리 및 성장과 분화를 유도하기 위해 특정 성장 인자의 사용이 필요합니다12. 따라서, 이들의 사용은 더 많은 시간이 소요되고이 원고에 설명 된 transwell 방법에 비해 더 많은 비용과 관련이 있습니다.
이 시험관 내 트랜스웰 시스템을 사용하여 장 상피를 가로지르는 박테리아 통과 평가는 다양한 병원체에 대해 성공적으로 수행되었습니다. 이 연구는 편광된 장 상피13,14,15를 가로질러 박테리아의 트랜스사이토시스를 특성화하기 위해 T84 세포를 사용하는 트랜스웰 시스템의 유용성을 보여주었습니다. 그러나, 균혈증 생성 신생아 대장균 균주의 트랜스사이토시스 능력을 비교하기 위한 이러한 트랜스웰 방법의 적용은 구체적으로 설명되지 않았다. 이 원고는 다른 연구자들에게 신뢰할 수 있고 사용하기 쉽고 너무 비싼 리소스를 필요로하지 않는 표준 트랜스 웰 프로토콜을 제공합니다.
장 상피를 트랜스사이토이스하는 신생아 침습성 대장균 균주의 능력을 비교하기 위해, 장 상피 단층의 정점 쪽은 알려진 수의 박테리아 세포에 감염될 수 있다. 배양 후, 상피의 기저측에있는 배지를 수집하고 박테리아를 정량화하여 시간 경과에 따른 박테리아 트랜스 사이토 시스의 양을 결정할 수 있습니다. 이 원고에서 제시된 방법은 균혈증으로 입원 한 신생아에서 회수 된 신생아 대장균 임상 균주의 트랜스 사이토 시스 능력을 연구하는 데 사용됩니다. transcytosis 연구를위한 이러한 신생아 임상 분리 물의 선택에 대한 포함 기준은 이전에 발표되었습니다 1,2,16. 이 방법을 다른 대장균 균주를 사용하여 수행하면 트랜스 사이토 시스 능력을 비교할 수 있습니다. 이 과정을 통해 장 transcytosis 모델은 신생아 균혈증의 발달로 절정에 달하는 다단계 과정에 기여하는 대장균의 독성 인자를 특성화하는 귀중한 데이터를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 위장병 학 및 전염병20에서 사용되는 기술로부터 유도된다. 장 상피 장벽의 시험관 내 모델은 내강 내용물이 선천성 면역의 관련 구성 요소와 상호 작용하는 메커니즘을 밝히기 위해 사용되었습니다 6,8. 침습성 신생아 대장균의 숙주-병원체 상호 작용은 또한 유전자 분석, 항생제 내성 연구 및 면역학적 기술<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 미주리 대학교 캔자스 시티 의과 대학에서 AI에 발행 한 Sarah Morrison 학생 보조금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
Riferimenti
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
