Quantifizierung von immungefärbtem Caspase-9 im Netzhautgewebe

Die Caspasen sind eine Familie von Proteasen, die den Entwicklungszelltod, die Immunantwort und den aberranten Zelltod bei Krankheit ^1,2 regulieren. Obwohl bekannt ist, dass Mitglieder der Caspase-Familie bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen induziert werden, ist es schwieriger zu verstehen, welche Caspase die Krankheitspathologie antreibt³. Solche Studien erfordern Werkzeuge, um die Funktion einzelner Caspase-Familienmitglieder zu identifizieren, zu charakterisieren und zu validieren. Die Analyse der relevanten einzelnen Caspasen ist sowohl aus mechanistischer als auch aus therapeutischer Sicht wichtig, da die Literatur mehrere Studien enthält, die die vielfältigen Rollen von Caspasen belegen ^4,5. Wenn das Ziel also darin besteht, eine Caspase bei einer Krankheit für einen therapeutischen Nutzen zu nutzen, ist es wichtig, die relevanten Familienmitglieder gezielt anzusprechen. Traditionelle Techniken zum Nachweis von Caspase-Spiegeln im Gewebe umfassen Western Blotting und enzymatische und fluorometrische Ansätze ^3,6. Keine dieser Maßnahmen ermöglicht jedoch einen zellspezifischen Nachweis von Caspase-Spiegeln, und in einigen Szenarien können gespaltene Caspasen oft nicht durch herkömmliche Proteinanalysemaßnahmen nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass Caspasen unterschiedliche apoptotische und nicht-apoptotische Rollen im selben Gewebe spielen können⁷, daher ist eine sorgfältige Charakterisierung der zellspezifischen Caspase-Spiegel erforderlich, um die Entwicklungs- und Krankheitswege genau zu verstehen.

Diese Studie zeigt die Aktivierung und Funktion von Caspase in einem Modell der neurovaskulären Hypoxie-Ischämie – retinale Venenokklusion (RVO)^7,8. In einem komplexen Gewebe wie der Netzhaut gibt es mehrere Zelltypen, die von der bei RVO induzierten Hypoxie-Ischämie betroffen sein können, einschließlich Gliazellen, Neuronen und Gefäßsystem⁷. In der adulten Netzhaut der Maus gibt es sehr wenig Expression von Caspasen in gesundem Gewebe, gemessen durch Immunhistochemie (IHC)⁷, aber das ist nicht der Fall während der Entwicklung⁹ oder in Modellen der Netzhauterkrankung^10,11. IHC ist eine Technik, die in der biomedizinischen Forschung gut etabliert ist und die Validierung von Krankheits- und pathologischen Zielen, die Identifizierung neuer Rollen durch räumliche Lokalisierung und die Quantifizierung von Proteinen ermöglicht hat. In Fällen, in denen gespaltene Caspase-Produkte nicht durch Western Blot oder fluorometrische Analyse nachgewiesen werden können, noch die spezifische Zellposition verschiedener Caspasen oder die Abfrage von Caspase-Signalwegen durch Lokalisierung, sollte IHC verwendet werden.

Um die Caspase(n) funktionell relevant in RVO zu bestimmen, wurde IHC mit validierten Antikörpern für Caspasen und zelluläre Marker verwendet. Die früheren Studien, die im Labor durchgeführt wurden, zeigten, dass Caspase-9 in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls und der Hemmung von Caspase-9 mit einem hochspezifischen Inhibitor, der vor neuronaler Dysfunktion und Tod geschützt war, schnell aktiviert wurde¹². Da die Netzhaut Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) ist, dient sie als Modellsystem, um die Rolle von Caspase-9 bei neurovaskulären Verletzungen abzufragen und weiter zu untersuchen¹³. Zu diesem Zweck wurde das Mausmodell von RVO verwendet, um die zellspezifische Lage und Verteilung von Caspase-9 und seine Bedeutung für neurovaskuläre Verletzungen zu untersuchen. RVO ist eine häufige Ursache für Erblindung bei Erwachsenen im erwerbsfähigen Alter, die auf eine Gefäßverletzung zurückzuführen^{ist 14}. Es wurde festgestellt, dass Caspase-9 in Endothelzellen nicht-apoptotisch exprimiert wurde, aber nicht in Neuronen.

Als Gewebe hat die Netzhaut den Vorteil, dass sie entweder als Flatmount visualisiert wird, was eine Wahrnehmung der vaskulären Netzwerke ermöglicht, oder als Querschnitte, die die neuronalen Netzhautschichten hervorheben. Die Quantifizierung der Caspase-Proteinexpression in Querschnitten liefert den Kontext, welcher Caspase potenziell entscheidend für die neuronale Konnektivität und Sehfunktion der Netzhaut ist, indem die Lokalisation der Caspase(n) in der Netzhaut identifiziert wird. Nach der Identifizierung und Validierung wird das Targeting der interessierenden Caspase durch induzierbare zellspezifische Deletion der identifizierten Caspase erreicht. Für mögliche therapeutische Fragestellungen wurde die Relevanz der interessierenden Caspasen mit spezifischen Werkzeugen zur Hemmung der aktivierten Caspase getestet. Für Caspase-9 wurde ein zellpermierter hochselektiver Inhibitor ^7,15, Pen1-XBIR3 verwendet. Für diesen Bericht wurden 2 Monate alter, männlicher C57BL/6J-Stamm und Tamoxifen-induzierbarer endothelialer Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund verwendet. Diese Tiere wurden dem Mausmodell von RVO ausgesetzt und C57BL/6J wurde mit dem selektiven Caspase-9-Inhibitor Pen1-XBir3 behandelt. Die beschriebene Methodik kann auf andere Krankheitsmodelle im zentralen und peripheren System angewendet werden ^7,15.