التحقيق في التعاون الميكروبي عن طريق التصوير تحليل قياس الطيف الكتلي للمستعمرات البكتيرية المزروعة على أجار وفي الأنسجة أثناء العدوى
Summary
تم عرض طريقة جديدة لإعداد العينات لتحليل المستعمرات البكتيرية الكبيرة القائمة على أجار عبر قياس الطيف الكتلي لتصوير الليزر / التأين بمساعدة المصفوفة.
Abstract
يمثل فهم العواقب الأيضية للتفاعلات الميكروبية التي تحدث أثناء العدوى تحديا فريدا لمجال التصوير الطبي الحيوي. يمثل قياس الطيف الكتلي للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) طريقة تصوير في الموقع خالية من الملصقات قادرة على توليد خرائط مكانية لمجموعة واسعة من الأيضات. في حين يتم الآن تحليل عينات الأنسجة المقسمة بشكل روتيني عبر هذه التقنية ، فإن تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويرية للركائز غير التقليدية ، مثل المستعمرات البكتيرية التي تزرع عادة على أجار في أبحاث علم الأحياء الدقيقة ، لا تزال صعبة بسبب ارتفاع محتوى الماء والتضاريس غير المستوية لهذه العينات. توضح هذه الورقة سير عمل إعداد العينة للسماح بتصوير تحليلات قياس الطيف الكتلي لأنواع العينات هذه. وتتمثل هذه العملية في استخدام مستعمرات كبيرة للاستزراع البكتيري المشترك لاثنين من مسببات الأمراض المعدية المعوية: المطثية العسيرة والمكورات المعوية البرازية. كما تبين أن دراسة التفاعلات الميكروبية في بيئة الآجار المحددة جيدا هذه تكمل دراسات الأنسجة التي تهدف إلى فهم التعاون الأيضي الميكروبي بين هذين الكائنين الممرضين في نماذج عدوى الفئران. يتم تقديم تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري لمستقلبات الأحماض الأمينية أرجينين وأورنيثين كبيانات تمثيلية. تنطبق هذه الطريقة على نطاق واسع على التحليلات الأخرى ، ومسببات الأمراض أو الأمراض الميكروبية ، وأنواع الأنسجة حيث يكون القياس المكاني للكيمياء الحيوية الخلوية أو الأنسجية مطلوبا.
Introduction
الميكروبيوم البشري هو نظام بيئي ديناميكي للغاية يتضمن تفاعلات جزيئية للبكتيريا والفيروسات والعتائق وغيرها من حقيقيات النوى الميكروبية. في حين تمت دراسة العلاقات الميكروبية بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، لا يزال هناك الكثير مما يجب فهمه حول العمليات الميكروبية على المستوى الكيميائي 1,2. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم توفر الأدوات القادرة على قياس البيئات الميكروبية المعقدة بدقة. أتاح التقدم في مجال قياس الطيف الكتلي التصويري (IMS) على مدار العقد الماضي رسم الخرائط المكانية في الموقع وبدون تسمية للعديد من المستقلبات والدهون والبروتينات في الركائز البيولوجية 3,4. برز الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) باعتباره أكثر تقنيات التأين شيوعا المستخدمة في تصوير قياس الطيف الكتلي ، بما في ذلك استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لاستئصال المواد من سطح قسم الأنسجة الرقيقة للقياس بواسطة قياس الطيفالكتلي 4. يتم تسهيل هذه العملية من خلال تطبيق مصفوفة كيميائية مطبقة بشكل متجانس على سطح العينة ، مما يسمح بإجراء قياسات متسلسلة في نمط نقطي عبر سطح العينة. ثم يتم إنشاء الخرائط الحرارية لشدة الأيونات المراد تحليلها بعد الحصول على البيانات. مكنت التطورات الحديثة في مصادر التأين وتقنيات أخذ العينات من تحليل الركائز غير التقليدية مثل العينات الخلوية البكتيرية 5 والثدييات 6،7،8 المزروعة على أجارالمغذيات. يمكن أن توفر المعلومات المكانية الجزيئية التي يوفرها IMS نظرة ثاقبة فريدة في الاتصالات الكيميائية الحيوية لتفاعلات الميكروب والميكروب المضيف أثناء العدوى9،10،11،12،13،14.
عند الإصابة بعدوى المطثية العسيرة (CDI) ، تتعرض المطثية العسيرة لبيئة ميكروبية سريعة التغير في الجهاز الهضمي ، حيث من المحتمل أن تؤثر التفاعلات متعددة الميكروبات على نتائج العدوى15،16. والمثير للدهشة أنه لا يعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية للتفاعلات بين المطثية العسيرة والميكروبات المقيمة أثناء العدوى. على سبيل المثال ، المكورات المعوية هي فئة من مسببات الأمراض المتعايشة الانتهازية في ميكروبيوم الأمعاء وقد ارتبطت بزيادة التعرض وشدة CDI17،18،19،20. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية للتفاعلات بين مسببات الأمراض هذه. لتصور اتصال الجزيئات الصغيرة بين أعضاء ميكروبيوم الأمعاء ، نمت المستعمرات البكتيرية هنا على أجار لمحاكاة تفاعلات الميكروب والميكروب وتكوين الأغشية الحيوية البكتيرية في بيئة خاضعة للرقابة. ومع ذلك ، فإن الحصول على توزيعات أيضية تمثيلية على تحليل قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI لعينات الثقافة البكتيرية يمثل تحديا بسبب المحتوى المائي العالي والتضاريس السطحية غير المستوية لهذه العينات. يحدث هذا إلى حد كبير بسبب الطبيعة المحبة للماء للغاية للأجار واستجابة سطح أجار غير المنتظمة أثناء إزالة الرطوبة.
كما أن المحتوى المائي العالي للأجار يمكن أن يجعل من الصعب تحقيق طلاء متجانس لمصفوفة MALDI ويمكن أن يتداخل مع تحليل MALDI اللاحق الذي يتم إجراؤه في الفراغ21. على سبيل المثال ، تعمل العديد من مصادر MALDI عند ضغوط تتراوح بين 0.1 و 10 Torr ، وهو فراغ كاف لإزالة الرطوبة من الآجار ويمكن أن يتسبب في تشوه العينة. هذه التغيرات المورفولوجية في الآجار الناجم عن بيئة الفراغ تسبب فقاعات وتشقق في مادة الآجار المجففة. تقلل هذه القطع الأثرية من التصاق الآجار بالشريحة ويمكن أن تتسبب في فك العينة أو تقشرها في نظام تفريغ الجهاز. يمكن أن يصل سمك عينات الآجار إلى 5 مم من الشريحة ، مما قد يؤدي إلى خلوص غير كاف من البصريات الأيونية داخل الجهاز ، مما يتسبب في تلوث و / أو تلف بصريات أيون الأجهزة. يمكن أن تؤدي هذه التأثيرات التراكمية إلى تخفيضات في الإشارة الأيونية العاكسة لتضاريس السطح ، بدلا من التفاعلات الكيميائية الحيوية الميكروبية الأساسية. يجب تجفيف عينات أجار بشكل متجانس والالتصاق بشدة بشريحة مجهرية قبل تحليلها في الفراغ.
توضح هذه الورقة سير عمل تحضير العينة للتجفيف المتحكم فيه للمستعمرات الكبيرة للثقافة البكتيرية المزروعة على وسط أجار. تضمن عملية التجفيف البطيئة متعددة الخطوات (مقارنة بتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا) أن الآجار سوف يجف بشكل موحد مع تقليل آثار الفقاعات أو تكسير عينات الآجار المثبتة على شرائح المجهر. باستخدام طريقة التجفيف التدريجي هذه ، يتم لصق العينات بشدة بشريحة المجهر وقابلة للتطبيق اللاحق للمصفوفة وتحليل MALDI. ويتجلى ذلك باستخدام مستعمرات بكتيرية نموذجية من المطثية العسيرة نمت على نماذج أنسجة الآجار والفئران التي تؤوي CDI مع وبدون وجود مسببات الأمراض المتعايشة والانتهازية ، المكورات المعوية البرازية. تسمح تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI لكل من النماذج البكتيرية والأنسجة برسم الخرائط المكانية لملامح مستقلب الأحماض الأمينية ، مما يوفر نظرة ثاقبة جديدة حول التمثيل الغذائي للميكروبات الحيوية والاتصالات.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء قياس الطيف الكتلي للتصوير MALDI ، من المهم أن يكون لديك سطح عينة مسطح لتوفير قطر بؤري ثابت لليزر MALDI الساقط على ركيزة العينة. يمكن أن تتسبب الانحرافات في ارتفاع العينة في انحراف شعاع الليزر MALDI عن التركيز ، مما يتسبب في حدوث تغييرات في قطر الحزمة وشدتها ، مما قد يؤثر على كفاءة تأين MALDI. يم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) بموجب جائزة GM138660. تم دعم JTS من قبل زمالة تشارلز ومونيكا بوركيت الصيفية للعائلة من جامعة فلوريدا. تم دعم JPZ من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة K22AI7220 (NIAID) و R35GM138369 (NIGMS). تم دعم ABS من خلال منحة التدريب على البيولوجيا الخلوية والجزيئية في جامعة بنسلفانيا (T32GM07229).
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
Riferimenti
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
