In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부
Summary
난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.
Abstract
깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질 (FMRP)은 국소 단백질 번역을 조절하는 mRNA 결합 단백질입니다. FMRP 손실 또는 기능 장애는 지적 장애, 감각 이상 및 사회적 의사 소통 문제를 특징으로 하는 취약 X 증후군(FXS)에서 비정상적인 신경 및 시냅스 활동을 유발합니다. FMRP 기능 및 FXS 발병 기전에 대한 연구는 주로 형질 전환 동물에서 Fmr1 (FMRP를 코딩하는 유전자) 녹아웃으로 수행되었습니다. 여기에서 우리는 닭 배아를 사용하여 회로 조립 및 시냅스 형성 기간 동안 FMRP의 세포 자율 기능을 결정하는 생체 내 방법을 보고합니다. 이 방법은 Fmr1 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 및 EGFP 리포터를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 단계, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다. 이 방법을 통해 우리는 청각 신경절 (AG)과 뇌간 표적 중 하나 인 핵 목장 세포 (NM)에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성하여 AG-NM 회로 내에서 구성 요소 별 조작을 제공했습니다. 또한 형질주입의 모자이크 패턴은 동물 내 대조군과 이웃 뉴런/섬유 비교를 가능하게 하여 데이터 분석의 신뢰성과 민감도를 향상시킵니다. 유도성 벡터 시스템은 축적된 발달 효과를 최소화하기 위해 유전자 편집 발병의 시간적 제어를 제공합니다. 이러한 전략의 조합은 시냅스 및 회로 개발에서 FMRP의 세포 자율 기능을 해부하는 혁신적인 도구를 제공합니다.
Introduction
취약 X 증후군(FXS)은 지적 장애, 감각 이상 및 자폐 행동을 특징으로 하는 신경 발달 장애입니다. 대부분의 경우 FXS는 초기 배아 단계1에서 시작하여 취약한 X 정신 지체 단백질 (FMRP, Fmr1 유전자에 의해 암호화 됨)의 전반적인 손실로 인해 발생합니다. FMRP는 일반적으로 뇌의 대부분의 뉴런과 신경교 세포와 감각 기관 2,3,4에서 발현되는 RNA 결합 단백질입니다. 포유류의 뇌에서 FMRP는 다양한 신경 활동에 중요한 단백질을 암호화하는 수백 개의 mRNA와 관련이있을 수 있습니다5. 기존의 Fmr1 녹아웃 동물에 대한 연구는 FMRP 발현이 시냅스 신경 전달의 조립 및 가소성에 특히 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 여러 조건부 및 모자이크 녹아웃 모델은 축삭 투영, 수지상 패턴 및 시냅스 가소성을 포함한 여러 발달 이벤트 동안 FMRP 작용 및 신호가 뇌 영역, 세포 유형 및 시냅스 부위에 따라 다양하다는 것을 추가로 입증했습니다. 7,8,9,10,11,12,13,14 . 시냅스 전달을 조절하는 FMRP의 급성 기능은 뇌 슬라이스 또는 배양 된 뉴런에서 억제 성 FMRP 항체 또는 FMRP 자체의 세포 내 전달에 의해 연구되었다 15,16,17,18. 그러나 이러한 방법은 개발 중 FMRP 오발현으로 인한 결과를 추적하는 기능을 제공하지 않습니다. 따라서, FMRP의 세포 자율 기능을 조사하기 위한 생체내 방법의 개발이 절실히 필요하며, FXS 환자에서 보고된 이상이 관련 뉴런 및 회로에서의 FMRP 손실의 직접적인 결과인지, 또는 발달 중 네트워크 전반의 변화로부터 유도된 이차적 결과인지를 결정하는 데 도움이 될 것으로 기대된다(19).
닭 배아의 청각 뇌간은 회로 및 시냅스 발달에서 FMRP 조절에 대한 심층 기능 분석에 매우 유리한 모델을 제공합니다. 배아 닭의 뇌에 쉽게 접근 할 수 있고 유전자 조작을위한 난자 전기 천공 기술에 잘 정립 된 기술은 초기 배아 단계의 뇌 발달에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 최근에 발표 된 연구에서이 기술은 FMRP 오발현20,21의 시간적 제어를 허용하는 고급 분자 도구와 결합되었습니다. 여기서, 방법론은 시냅스 전 뉴런과 시냅스 후 뉴런의 선택적 조작을 개별적으로 유도하기 위해 발전됩니다. 이 방법은 청각 뇌간 회로에서 개발되었습니다. 음향 신호는 청각 내이의 유모 세포에 의해 감지 된 다음 청각 신경절 (AG, 포유류에서는 나선형 신경절이라고도 함)으로 전달됩니다. AG의 양극성 뉴런은 말초 과정으로 유모 세포를 자극하고 차례로 중앙 투영 (청각 신경)을 뇌간으로 보내 두 개의 주요 달팽이관 핵 인 마그노 셀룰라 핵 (NM)과 각진 핵 (NA)에서 끝납니다. NM의 뉴런은 구조적으로나 기능적으로 포유류 전방 복부 달팽이관 핵의 구형 덤불 세포와 비슷합니다. NM 내에서 청각 신경 섬유(ANF) 시냅스는 헬드 말단22의 큰 말단을 통해 NM 뉴런의 체세포에 있습니다. 발달 동안, NM 뉴런은 후뇌23의 능형 5 및 6 (r5/6)에서 발생하는 반면, AG 뉴런은 이낭24에 존재하는 신경 모세포로부터 유래된다. 여기에서는 시냅스 전 AG 뉴런과 시냅스 후 NM 뉴런에서 FMRP 발현을 선택적으로 녹다운하는 절차를 별도로 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FMRP의 세포 자율 기능을 결정하기 위해서는 개별 세포 그룹 또는 세포 유형에서 발현을 조작해야합니다. FMRP의 주요 기능 중 하나는 시냅스 형성과 가소성을 조절하는 것이므로 특정 회로의 각 시냅스 구성 요소를 선택적으로 조작하는 것은 시냅스 통신에서 FMRP 메커니즘을 완전히 이해하기 위한 전제 조건입니다. 닭 배아의 난자 전기천공을 사용하여 시냅스 전 AG ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (No. 32000697); 광저우 과학 기술 프로그램 (202102080139); 광동 자연 과학 재단 (2019A1515110625, 2021A1515010619); 중앙 대학을위한 기초 연구 기금 (11620324); 지난 대학 교육부 재생 의학 핵심 실험실의 연구 보조금 (No. ZSYXM202107); 중국 중앙 대학 기초 연구 기금 (21621054); 그리고 중국 광동성 의료 과학 연구 재단 (20191118142729581). 지난 대학의 의료 실험 센터에 감사드립니다. 원고를 신중하게 편집해 주신 테라 브래들리 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
Riferimenti
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