Organotypische retinale explantculturen van makaken

Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood en wordt veroorzaakt door mutaties in een grote verscheidenheid aan pathogene genen¹. Het eindresultaat van RD is verlies van het gezichtsvermogen en in de overgrote meerderheid van de gevallen blijft de ziekte tot op de dag van vandaag onbehandelbaar. Daarom is het belangrijk om de cellulaire mechanismen te bestuderen die leiden tot fotoreceptordood met behulp van modellen die de menselijke ziektetoestand getrouw weergeven. Hier zijn op primaten gebaseerde modellen van bijzonder belang vanwege hun nabijheid tot de mens. Met name kunnen dergelijke modellen de ontwikkeling bevorderen van geschikte therapeutische interventies die fotoreceptorceldood kunnen stoppen of vertragen.

Eerder onderzoek naar de mechanismen van celdood bij RD heeft aangetoond dat de afname of het verlies van fosfodiësterase 6 (PDE6) activiteit veroorzaakt door RD-triggerende genmutaties leidt tot verminderde hydrolyse van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP)^2,3. cGMP is een specifieke agonist van de cyclische nucleotide-gated ionkanalen (CNGCs) in de staafbuitensegmenten (ROSs) en is ook een sleutelmolecuul dat verantwoordelijk is voor de omzetting van lichtsignalen in elektrische signalen in gewervelde fotoreceptorcellen⁴. Verminderde cGMP-hydrolyse veroorzaakt de accumulatie van cGMP in ROSs, wat leidt tot de opening van CNGCs ⁵. Bijgevolg worden de fototransductieroutes geactiveerd, wat resulteert in een toename van kationconcentraties in fotoreceptorcellen. Dit proces legt een metabole belasting op fotoreceptoren, die bij overactivering, bijvoorbeeld door mutaties in PDE6, celdood kunnen veroorzaken.

Veel studies hebben aangetoond dat een significante overaccumulatie van cGMP in fotoreceptoren van muismodellen met verschillende RD-genmutaties de activering van cGMP-afhankelijk eiwitkinase (PKG)^3,6 kan veroorzaken. Dit leidt tot een aanzienlijke toename van afstervende, TUNEL-positieve cellen en een geleidelijke verdunning van de fotoreceptorcellaag. Eerdere studies suggereren dat PKG-overactivatie veroorzaakt door verhoogde cGMP-niveaus een noodzakelijke en voldoende voorwaarde is voor de inductie van fotoreceptorceldood ^2,5. Studies op verschillende muismodellen van RD hebben ook aangetoond dat PKG-activering geïnduceerd door verhoogde cGMP-niveaus in fotoreceptoren, leidt tot overactivatie van downstream-effectoren zoals poly-ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), histon deacetylase (HDAC) en calpaïne 2,7,8,9. Dit impliceert causale associaties tussen deze verschillende doeleiwitten en fotoreceptorceldood.

Eerder onderzoek naar de pathologie, toxicofarmacologie en therapie van RD was echter voornamelijk gebaseerd op muismodellen voor RD^10,11,12. Niettemin blijven er enorme moeilijkheden bestaan bij de klinische vertaling van deze resultaten. Dit komt door de aanzienlijke genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, vooral met betrekking tot de netvliesstructuur. Daarentegen delen niet-menselijke primaten (NHP’s) ook een hoge mate van gelijkenis met mensen met betrekking tot genetische kenmerken, fysiologische patronen en regulatie van omgevingsfactoren. Zo werd optogenetische therapie onderzocht als middel om de retinale activiteit te herstellen in een NHP-model¹³. Lingam en collega’s toonden aan dat goede productiepraktijken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide retinale fotoreceptorvoorlopercellen kegelfotoreceptorschade in NHP¹⁴ kunnen redden. Daarom zijn NHP-modellen belangrijk voor de verkenning van RD-pathogenese en de ontwikkeling van effectieve behandelmethoden. In het bijzonder zouden NHP-modellen van RD, die pathogene mechanismen vertonen die vergelijkbaar zijn met die bij mensen, een cruciale rol kunnen spelen in studies over de ontwikkeling en in vivo toxicofarmacologische analyse van nieuwe geneesmiddelen.

Gezien de lange levenscyclus, het hoge niveau van technische problemen en de hoge kosten die gemoeid zijn met het opzetten van in vivo primatenmodellen, hebben we een in vitro niet-menselijk primaat (NHP) model opgesteld met behulp van culturen van geëxplanteerde makaken netvlies. Eerst werden wild-type makaken van 1-3 jaar oud geselecteerd voor in vitro kweek van retinale explantaten, waaronder het retina-RPE-choroïde complex. Explants werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM) om de cGMP-PKG-signaalroute te induceren. Fotoreceptorceldood werd gekwantificeerd en geanalyseerd met behulp van de TUNEL-test en cGMP-accumulatie in explantaten werd geverifieerd via immunofluorescentie. Gezien de hoge mate van gelijkenis met betrekking tot celverdeling en morfologie, dikte van de retinale laag en andere fysiologische kenmerken van het netvlies tussen apen en mensen, kan de vaststelling van de cGMP-PKG-signaleringsroute in het in vitro retinale model toekomstig onderzoek naar de pathogenese van RD vergemakkelijken, evenals studies naar de ontwikkeling en toxicofarmacologie van nieuwe geneesmiddelen voor RD-behandeling.