Detta protokoll beskriver tre metoder för administrering av kardioaktiva terapeutiska medel i en svinmodell. Lantrashonor behandlades antingen: (1) torakotomi och transepikardiell injektion, (2) kateterbaserad transendokardiell injektion eller (3) intravenös infusion via jugularvenosmotisk minipump.
Hjärtinfarkt är en av de främsta orsakerna till dödsfall och funktionshinder i världen, och det finns ett akut behov av nya hjärtskyddande eller regenerativa strategier. En viktig del av läkemedelsutvecklingen är att bestämma hur en ny behandling ska administreras. Fysiologiskt relevanta stordjursmodeller är av avgörande betydelse för att bedöma genomförbarheten och effektiviteten av olika terapeutiska leveransstrategier. På grund av deras likheter med människor i kardiovaskulär fysiologi, kranskärlsanatomi och hjärtvikt i förhållande till kroppsvikt är svin en av de föredragna arterna i den prekliniska utvärderingen av nya terapier för hjärtinfarkt. Detta protokoll beskriver tre metoder för administrering av kardioaktiva terapeutiska medel i en svinmodell. Efter perkutan inducerad hjärtinfarkt behandlades honsvinen av lantras med nya medel genom antingen: (1) torakotomi och transepikardiell injektion, (2) kateterbaserad transendokardiell injektion eller (3) intravenös infusion via jugularvenosmotisk minipump. De procedurer som används för varje teknik är reproducerbara, vilket resulterar i tillförlitlig kardioaktiv läkemedelstillförsel. Dessa modeller kan enkelt anpassas för att passa individuella studiedesigner, och var och en av dessa leveranstekniker kan användas för att undersöka en mängd olika möjliga interventioner. Därför är dessa metoder ett användbart verktyg för translationella forskare som söker nya biologiska metoder för hjärtreparation efter hjärtinfarkt.
Kranskärlssjukdom (CAD) och tillhörande hjärtinfarkt med ST-höjning (STEMI) är de vanligaste dödsorsakerna i världen. Under de senaste två decennierna har stora framsteg gjorts när det gäller att minska dödligheten på sjukhus hos patienter med STEMI, genom tillkomsten av perkutan koronarintervention, fibrinolytiska terapier och standardisering av behandlingsalgoritmer för att säkerställa att reperfusion uppnås i tid 1,2,3. Trots detta är sjukligheten i samband med STEMI fortfarande en betydande börda, vilket skapar ett stort behov av att utveckla nya hjärtskyddande och regenerativa terapier 2,3. En viktig del av den terapeutiska utvecklingen är att bestämma hur en ny behandlingska administreras. Säkerheten, effektiviteten och genomförbarheten för varje metod måste matchas med egenskaperna hos själva behandlingen.
Fysiologiskt relevanta stordjursmodeller är avgörande för att bedöma dessa egenskaper hos olika terapeutiska leveransstrategier5. På grund av deras likheter med människor i kardiovaskulär fysiologi, kranskärlsanatomi och hjärtvikt i förhållande till kroppsvikt är svin en av de föredragna arterna i den prekliniska utvärderingen av nya terapier för hjärtinfarkt6. Vi har tidigare använt en STEMI-modell från svin för att demonstrera den reparativa kapaciteten hos en rekombinant proteinterapi7, och fortsätter att undersöka nya farmakologiska, cellulära och genetiska terapier med hjälp av denna modell. Här beskrivs tre tekniker för terapeutisk administrering som används i svinmodeller efter att infarkt bildats: torakotomi och transepikardiell injektion, perkutan transendokardiell injektion och jugular venös osmotisk minipumpimplantation. De två första metoderna möjliggör lokal vävnadstillförsel, vilket minskar nödvändiga doser, off-target-effekter och levermetabolism 8,9,10. Den osmotiska minipumpen möjliggör kontinuerlig tillförsel av ett läkemedel med kort halveringstid, vilket gör att man inte längre behöver förlita sig på en infusionspump och en patenterad intravenös kanyl, som båda är utmanande att införa i stora djurmodeller.
Genom att beskriva dessa tekniker hoppas vi att denna artikel kan hjälpa translationella forskare att undersöka nya hjärtskyddande eller regenerativa medel efter hjärtinfarkt i stora djurmodeller.
Transepikardiell intramyokardinjektion
Denna procedur har fördelen av direkt hjärtvisualisering och har visat sig ge större lokal retention av terapier än systemiska administreringsmetoder 9,10,14. Torakotomier är dock invasiva, kräver stor teknisk skicklighet och utgör en större risk för sjuklighet och dödlighet än andra metoder som diskuterats10,15. Kunskap om de kritiska och osäkra stadierna i förfarandet kan hjälpa till att hantera denna ökade risk.
Stor försiktighet måste iakttas vid manipulering av hjärtat för att exponera hjärtats apex på grund av den höga risken för arytmi och tillhörande hemodynamisk kompromettering. Kontinuerlig invasiv blodtrycksövervakning och elektrokardiografi möjliggör snabb identifiering av hypotoni eller instabila arytmier, vilket underlättar snabbt ingripande och korrigering. Övergående hypotoni kan i allmänhet behandlas med metaraminolbolusar. Ihållande hypotoni kan temporeras genom att minska inhalationsanestesien (noggrann övervakning av anestesidjupet) och påbörja en vasopressorinfusion, samtidigt som orsaken till förändrad hemodynamik fastställs. Instabila arytmier, såsom kammartakykardi eller kammarflimmer, kan behandlas med elkonvertering med eller utan intravenösa antiarytmika.
Lika viktigt för djurens överlevnad är att framgångsrikt avlägsna fri gas från pleurahålan innan bröstkorgen stängs. Om man inte gör det kan det leda till att man utvecklar en pneumothorax, vilket gör att djuret löper stor risk att drabbas av andningsproblem och dö när det kopplas bort från den mekaniska respiratorn vid återhämtning. Det positiva luftvägstrycket måste bibehållas i minst 30 s tills bubblor inte längre observeras. Silikonslangen avlägsnas omedelbart när bubblingen upphör, och bröstkorgen stängs sedan snabbt. Det är också möjligt att kirurgiskt placera en torakostomisond vid stängning, vilket möjliggör manuellt avlägsnande av luft och inflammatorisk vätska under de kommande 24-72 timmarna. Detta är dock svårt att hålla rent och intakt, särskilt om djuren hålls tillsammans. Skada eller kontaminering av sonden kan leda till pyothorax, pneumothorax eller sepsis. Enligt vår erfarenhet är det inte nödvändigt att sätta in ett tillfälligt thoraxdränage om fri gas avlägsnas tillräckligt innan bröstkorgen stängs.
Perkutan transendokardiell intramyokardinjektion
Fördelen med denna metod är att den möjliggör lokal vävnadstillförsel med lägre risk på grund av dess mindre invasiva karaktär jämfört med en kirurgisk metod10,14. Denna teknik används redan i stordjursstudier, med både fluoroskopi och elektromekanisk kartläggning som vägledning i avsaknad av direkt visualisering10,16,17.
Med tanke på att hjärtat inte är under direkt syn, är det klokt för proceduralisten att använda ortogonala fluoroskopiska vyer när han väljer ett injektionsställe. Dessutom är injektion av utspädd jodkontrast före och leverans av läkemedlet extremt värdefullt för att bekräfta myokardkontakt. Lämplig kontakt kan bekräftas genom att observera en karakteristisk “myokardrodnad”, som kan vara en av de enda markörerna för lyckad injektion före vävnadsskörd. På grund av risken för kammarperforering rekommenderas också att myokardväggens tjocklek vid det valda injektionsstället är större än 9 mm14,16.
Jugulär venös osmotisk minipump
Den osmotiska minipumpen är en populär enhet som ofta används i smådjursstudier. Det har funnits ett ökande intresse för att använda denna enhet i stora djurmodeller 7,18,19, med tanke på dess unika fördel att administrera ett terapeutiskt medel i en jämn takt under en viss tidsperiod. En möjlig begränsning av denna metod är oförmågan att ändra eller stoppa infusionshastigheten av läkemedlet utan att byta ut eller ta bort pumpen. Detta bör övervägas innan man provar behandling på detta sätt.
Denna studie visade att denna metod kunde utföras med en hög framgångsfrekvens i svin, med låg sjuklighet och dödlighet. Det måste noteras att många vitala strukturer ligger intill operationsstället, inklusive lymfkörtlar, bräss och halspulsådern. Att följa metoden och konsultera anatomiska texter20 rekommenderas starkt för att förhindra oavsiktlig skada på någon av dessa strukturer. Den mest oroande komplikationen av denna metod är hemorragisk chock på grund av oavsiktlig skada på halsvenen eller en omgivande struktur. Det är därför viktigt att den mjuka vävnaden som omger halsvenen avlägsnas försiktigt. Om detta steg inte slutförs korrekt kan det leda till svårigheter att placera minipumpslangen eller kontrollera oavsiktlig blödning.
Den här artikeln har beskrivit tre metoder för leverans av kardioaktiva läkemedel. Trots den rapporterade framgången för varje teknik finns det inneboende begränsningar att ta hänsyn till. Invasiva procedurer (transepikardiell injektion) möjliggör ökad noggrannhet i terapeutisk leverans; De medför dock en större risk för potentiellt dödliga komplikationer. Dessutom har invasiv förlossning ett större krav på teknisk kompetens för att minimera risken för komplikationer. På samma sätt kräver fluoroskopstyrd, transendokardiell injektion en viss grad av teknisk skicklighet för kateterisering och manipulering av hårdvara. Om denna metod utförs felaktigt kan injektionsfel och dödliga komplikationer uppstå.
De beskrivna direktinjektionsmetoderna gör det möjligt att administrera ett läkemedel vid ett enstaka tillfälle i målvävnaden. Den jugularvenösa osmotiska minipumpen möjliggör systemisk administrering av en terapeutisk behandling under en 7-dagarsperiod. Jämförelsevis är denna metod enklare och förknippad med mindre risk, men den bygger på att en systemisk terapi hittar sin väg till hjärtmuskeln. När pumpen väl är på plats är det dessutom omöjligt att avbryta administreringen eller ändra dosraten utan att bedöva djuret på nytt och ta bort pumpen.
Alla metoder som beskrivs i denna artikel utfördes på djur dagen eller 2 veckor efter hjärtinfarkt. Därför kan detta arbete inte rapportera framgången med nämnda metoder hos friska djur eller djur som utsätts för en alternativ hjärtpatologi. Slutligen bör farmakologi och bioteknik för alla avsedda medel övervägas noggrant, eftersom detta i sig kommer att vara kopplat till effektiviteten hos den valda leveransvägen. En detaljerad diskussion om detta ligger utanför ramen för detta manuskript.
Omfattande skildringar av prekliniska metoder gynnar djurens välbefinnande och det bredare vetenskapliga samfundet. Den resulterande förbättrade reproducerbarheten av förfaranden och resultat leder till färre djurhälsokomplikationer, minskat antal djur som krävs för att producera betydande resultat och större förtroende för experimentella resultat21,22. Tre metoder för administrering av nya läkemedel beskrivs i denna artikel för behandling av hjärtinfarkt i en svinmodell. Genom att beskriva de tekniker som används och formulera fördelarna och riskerna med var och en, förväntas det att forskare bekvämt kommer att kunna skapa konsekventa och tillförlitliga prekliniska modeller som passar deras forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av anslag från National Health and Medical Research Council APP1194139/APP1126276 (JC), National Stem Cell Foundation of Australia och New South Wales Government Office of Health and Medical Research (JC). DS stöddes av Royal Australasian College of Physicians, Institute of Clinical Pathology and Medical Research och Australian Government Research Training Program. TD stöddes av Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Penfolds Family Scholarship, National Health and Medical Research Council (APP2002783) och National Heart Foundation of Australia (104615).
Central line placement | |||
2-0 sutures | Ethicon | JJ9220 | |
Arrow' Paediatric Two-Lumen Central Venous Catheterisation Set with Blue FlexTip Catheter (contains 18G cook needle and 0.035" J-tip wire) | Teleflex | CS-14502 | Central Line |
Green Fluorsence Protein (GFP) | Abcam | ab13970 | 1:100 dilution ratio |
Histology antibodies | |||
Ku80 | Cell Signalling Technology | C48E7 | 1:500 dilution ratio |
No. 11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile ultrasound probe cover | Atris | 28041947 | |
Swine Jacket with Pocket, size 'Medium' | Lomir Biomedical | SS J2YJJET | |
Jugular vein osmotic minipump implantation | |||
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
Bellucci Self-Retaining Retractor | surgicalinstruments.net.au | group-24.26.02 | Self retaining tissue retractor |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel blade | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, 663G | |
Osmotic Infusion Minipump | Alzet | 2ML1, 2ML2, 2ML4 | |
Vascular Silicone Ties | Vecmedical | 95001 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | W9982 | |
Percutaneous transedocardial injection | |||
Artis Zee' C-Arm Fluoroscopy | Siemens | IR-19-1994 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Myostar' Injection Catheter | Biosense Webster | 121117S, 121119S, 1211120S | Intramyocardial injection catheter |
No.11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Omnipaque' Iohexol Contrast | GE Healthcare | AUST R 39861 | Iodinated contrast agent |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sedation & general anaesthesia | |||
Compound Sodium Lactate Hartmann's Solution | Free flex | 894451 | |
Fentanyl 50 mcg/mL | Pfizer | AUST R 107027. | Intravenous anaesthesia and analgesia |
Forthane' Isoflurane | Abbott | AUST R 29656 | Inhalant anaesthetic |
GE Aestiva 5 Anaesthesia Machine | Datex Ohmeda | 17002-9, 17002A9 Avante Health Solutions | Anaesthetic Machine |
Hypnovel' Midazolam 5 mg/mL | Roche | AUST R 13726 | Sedative |
Intravenous cannula | BD Angiocath | 381137 | 20 gauge cannula |
Ketamil' Ketamine 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 51188c | Sedative |
Laryngoscope | Miller | VDI-6205 | |
Medetomidine 1 mg/mL | Ilium | APVMA number 64251; ACVM number A10488 | Sedative |
Metaraminol 10 mg/mL | Phebra | AUST R 284784 | Short-acting vasopressor |
Methadone 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 63712 | Sedative, Restricted drug |
Onsetron' Ondansetron 2 mg/mL | Accord Healthcare | AUST R 205593 | Anti-emetic |
Propofol-Lipuro' Propofol 10 mg/mL | Braun | AUST R 142906 | Intravenous anaesthetic |
Pulse Oximeter | Meditech | GVPMT-M3S | Portable pulse oximeter |
Shiley' Cuffed Basic Endotracheal Tube (Size 5.5 & 6.0) | Medtronic | 86108-, 86109- | |
Shiley' Intubating Stylet, 10 Fr | Medtronic | 85864 | |
Sodium Chloride 0.9% | Free flex | FAH1322 | |
Thoracotomy and epicardial Cell Injection | |||
27 G Insulin needle | Terumo | 51907 | |
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cefazolin 1 g Vial | AFT Pharmaceuticals | 9421900137367 CH2 | Antibiotic Prophylaxis |
Chest drainage tube | SurgiVet | SKU-336 | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Cooley Sternotomy Retractor Paediatric | Millennium Surgical | 9-61287 | |
Durogesic' 100 mcg/h Fentanyl Patch | Janssen | AUST R 112371 | Postoperative analgesia |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Lignocaine 20 mg/mL | Pfizer | AUST R 49296, AUST R 49297, AUST R 49293 and AUST R 49295. | Local anaesthesia, anti-arrhythmic |
Marcaine' Bupivacaine 0.5% | Pfizer | AUST R 48328 | Local anaesthesia. |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, JJ76264 | |
Size 1 PDS suture | Ethicon | JJ75414 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile gauze | Kerlix | KE5072 | |
Sterile laparotomy sponges | Propax | 2907950 | |
Thermocool Smartouch' Catheter | Biosense Webster | D133601, D133602, D133603 | Epicardial Mapping Catheter |