Denne protokol beskriver tre metoder til administration af kardioaktive terapeutiske midler i en svinemodel. Kvindelige landracesvin modtog behandling gennem enten: (1) thoracotomi og transepikardieinjektion, (2) kateterbaseret transendokardieinjektion eller (3) intravenøs infusion via jugular veneosmotisk minipumpe.
Myokardieinfarkt er en af de førende årsager til død og handicap på verdensplan, og der er et presserende behov for nye kardioprotektive eller regenerative strategier. En væsentlig komponent i lægemiddeludvikling er at bestemme, hvordan en ny terapeutisk skal administreres. Fysiologisk relevante store dyremodeller er af afgørende betydning for vurderingen af gennemførligheden og effektiviteten af forskellige terapeutiske leveringsstrategier. På grund af deres ligheder med mennesker i kardiovaskulær fysiologi, koronar vaskulær anatomi og hjertevægt til kropsvægtforhold er svin en af de foretrukne arter i den prækliniske evaluering af nye terapier til myokardieinfarkt. Denne protokol beskriver tre metoder til administration af kardioaktive terapeutiske midler i en svinemodel. Efter perkutant induceret myokardieinfarkt modtog hunsvin af landrace behandling med nye stoffer gennem enten: (1) thoracotomi og transepikardieinjektion, (2) kateterbaseret transendokardieinjektion eller (3) intravenøs infusion via jugular veneosmotisk minipumpe. De procedurer, der anvendes til hver teknik, er reproducerbare, hvilket resulterer i pålidelig kardioaktiv lægemiddelafgivelse. Disse modeller kan let tilpasses til individuelle undersøgelsesdesign, og hver af disse leveringsteknikker kan bruges til at undersøge en række mulige interventioner. Derfor er disse metoder et nyttigt værktøj for translationelle forskere, der forfølger nye biologiske tilgange til hjertereparation efter myokardieinfarkt.
Koronararteriesygdom (CAD) og tilhørende ST-elevation myokardieinfarkt (STEMI) er de fremtrædende dødsårsager på verdensplan. I de sidste to årtier er der gjort store fremskridt med at reducere dødeligheden på hospitalet hos patienter, der præsenterer STEMI, gennem fremkomsten af perkutan koronar intervention, fibrinolytiske terapier og standardisering af behandlingsalgoritmer for at sikre, at reperfusion opnås rettidigt 1,2,3. På trods af dette er sygeligheden forbundet med STEMI fortsat en betydelig byrde, hvilket skaber et stort behov for at udvikle nye kardiobeskyttende og regenerative terapier 2,3. En væsentlig komponent i terapeutisk udvikling er bestemmelsen af, hvordan en ny behandling skal administreres4. Sikkerheden, effektiviteten og gennemførligheden af hver metode skal matches med egenskaberne ved selve terapien.
Fysiologisk relevante store dyremodeller er afgørende for vurderingen af disse egenskaber ved forskellige terapeutiske leveringsstrategier5. På grund af deres ligheder med mennesker i kardiovaskulær fysiologi, koronar vaskulær anatomi og hjertevægt til kropsvægtforhold er svin en af de foretrukne arter i den prækliniske evaluering af nye terapier til myokardieinfarkt6. Vi har tidligere brugt en STEMI-model til svin til at demonstrere reparativ kapacitet af en rekombinant proteinterapi7 og fortsætter med at undersøge nye farmakologiske, cellulære og genetiske terapier ved hjælp af denne model. Her beskrives tre teknikker til terapeutisk administration, der anvendes i svinemodeller efter infarktdannelse: thoracotomi og transepikardieinjektion, perkutan transendokardieinjektion og jugular venøs osmotisk minipumpeimplantation. De to første metoder muliggør lokal vævstilførsel, hvilket reducerer nødvendige doser, off-target effekter og hepatisk first-pass metabolisme 8,9,10. Den osmotiske minipumpe tillader kontinuerlig levering af et lægemiddel med en kort halveringstid, hvilket ophæver afhængigheden af en infusionspumpe og patentintravenøs kanyle, som begge er udfordrende at indføre i store dyremodeller.
Ved at beskrive disse teknikker håber man, at denne artikel kan hjælpe translationelle forskere med at undersøge nye kardioprotektive eller regenerative midler efter myokardieinfarkt i store dyremodeller.
Transepikardial intramyokardieinjektion
Denne procedure har fordelen ved direkte hjertevisualisering og har vist sig at give større lokal retention af terapi end systemiske administrationsmetoder 9,10,14. Imidlertid er thoracotomier invasive, kræver betydelig teknisk dygtighed og udgør en større risiko for sygelighed og dødelighed end andre metoder, der diskuteres10,15. Kendskab til de kritiske og usikre faser af proceduren kan bidrage til at afhjælpe denne øgede risiko.
Der skal udvises stor omhu ved manipulation af hjertet for at udsætte hjertespidsen på grund af den store risiko for arytmi og tilhørende hæmodynamisk kompromis. Kontinuerlig invasiv blodtryksovervågning og elektrokardiografi muliggør hurtig identifikation af hypotension eller ustabile arytmier, hvilket letter hurtig indgriben og korrektion. Forbigående hypotension kan generelt behandles med metaraminolboluser. Vedvarende hypotension kan midlertidigt indstilles ved at reducere inhalationsbedøvelse (omhyggelig overvågning af anæstesidybden) og påbegynde en vasopressorinfusion, samtidig med at årsagen til ændret hæmodynamik bestemmes. Ustabile arytmier, såsom ventrikulær takykardi eller ventrikelflimmer, kan behandles ved elektrisk kardioversion med eller uden intravenøs antiarytmika.
Lige så vigtigt for dyrs overlevelse er den vellykkede fjernelse af fri gas fra pleurhulen, inden brystet lukkes. Undladelse af at gøre det kan kulminere i at udvikle en pneumothorax, hvilket efterlader dyret i stor risiko for åndedrætsbesvær og død, når det er afbrudt fra den mekaniske ventilator ved genopretning. Det positive luftvejstryk skal opretholdes i mindst 30 s, indtil der ikke længere observeres bobler. Silikoneslangen fjernes straks ved ophør af boblende, og brystkassen lukkes derefter hurtigt. Det er også muligt kirurgisk at placere et thoracostomirør ved lukning, hvilket tillader manuel fjernelse af luft og inflammatorisk væske i løbet af de næste 24-72 timer. Dette er dog svært at holde rent og intakt, især hvis dyrene er anbragt sammen. Skader eller forurening af røret kan føre til pyothorax, pneumothorax eller sepsis. Det er vores erfaring, at det ikke er nødvendigt at indsætte et midlertidigt brystdræn, hvis fri gas fjernes tilstrækkeligt inden lukning af brystet.
Perkutan transendokardial intramyokardieinjektion
Denne metode til terapeutisk administration har den fordel, at den giver mulighed for lokal vævstilførsel med lavere risiko på grund af dens mindre invasive karakter sammenlignet med en kirurgisk tilgang10,14. Denne teknik anvendes allerede i store dyreforsøg, med både fluoroskopi og elektromekanisk kortlægning som vejledning i fravær af direkte visualisering10,16,17.
Da hjertet ikke er under direkte syn, er det klogt for proceduralisten at bruge ortogonale fluoroskopiske synspunkter, når de vælger et injektionssted. Desuden er injektionen af fortyndet jodkontrast før og levering af den terapeutiske yderst værdifuld til bekræftelse af myokardiekontakt. Passende kontakt kan bekræftes ved at observere en karakteristisk ‘myokardierødme’, som kan være en af de eneste markører for injektionssucces før vævshøst. På grund af risikoen for kammerperforering anbefales det også, at tykkelsen på myokardievæggen på det valgte injektionssted er større end 9 mm14,16.
Jugular venøs osmotisk minipumpe
Den osmotiske minipumpe er en populær enhed, der almindeligvis anvendes i smådyrsforsøg. Der har været stigende interesse for at bruge denne enhed i store dyremodeller 7,18,19 i betragtning af dens unikke fordel ved at administrere et terapeutisk middel med en ensartet hastighed over en bestemt tidsperiode. En mulig begrænsning af denne metode er manglende evne til at ændre eller stoppe infusionshastigheden af lægemidlet uden at udskifte eller fjerne pumpen. Dette bør overvejes, før behandling på denne måde afprøves.
Denne undersøgelse viste, at denne metode kunne udføres med en høj succesrate hos svin, med lav sygelighed og dødelighed. Det skal bemærkes, at mange vitale strukturer støder op til det kirurgiske sted, herunder lymfeknuder, thymus og halspulsåren. Overholdelse af metoden og høring af anatomiske tekster20 anbefales kraftigt for at forhindre utilsigtet skade på nogen af disse strukturer. Den mest bekymrende komplikation ved denne metode er hæmoragisk chok på grund af utilsigtet skade på halsvenen eller en omgivende struktur. Det er derfor afgørende, at det bløde væv, der omgiver halsvenen, fjernes omhyggeligt. Hvis dette trin ikke udføres korrekt, kan det medføre problemer med at placere minipumpeslangen eller kontrollere utilsigtet blødning.
Denne artikel har beskrevet tre metoder til levering af kardioaktive terapi. På trods af den rapporterede succes med hver teknik er der iboende begrænsninger, der skal overvejes. Invasive procedurer (transepikardieinjektion) giver mulighed for øget nøjagtighed af terapeutisk levering; De medfører dog en større risiko for potentielt dødelige komplikationer. Desuden har invasiv levering et større krav til tekniske færdigheder for at minimere risikoen for komplikationer. På samme måde kræver fluoroskopisk styret, transendokardial injektion en grad af teknisk færdighed til kateterisering og manipulation af hardware. Hvis denne metode udføres forkert, er injektionssvigt og dødelige komplikationer mulige.
De beskrevne metoder til direkte injektion giver mulighed for engangsindgivelse af et terapeutisk middel i målvævet. Den jugulære venøse osmotiske minipumpe muliggør systemisk administration af en terapeutisk over en periode på 7 dage. Til sammenligning er denne metode enklere og forbundet med mindre risiko, men den er afhængig af en systemisk terapeutisk at finde vej til myokardiet. Når pumpen først er på plads, er det desuden umuligt at afbryde administrationen eller ændre dosishastigheden uden at bedøve dyret igen og fjerne pumpen.
Alle metoder beskrevet i denne artikel blev udført på dyr på dagen eller 2 uger efter myokardieinfarkt. Derfor kan dette arbejde ikke rapportere succesen med nævnte metoder hos raske dyr eller dyr, der udsættes for en alternativ hjertepatologi. Endelig skal farmakologien og bioteknologien af ethvert bestemt agens overvejes nøje, da dette vil være uløseligt forbundet med effektiviteten af den valgte indgivelsesvej. En detaljeret diskussion af dette ligger uden for rammerne af dette manuskript.
Omfattende skildringer af prækliniske metoder gavner dyrevelfærden og det bredere videnskabelige samfund. Den deraf følgende forbedrede reproducerbarhed af forsøg og resultater fører til færre dyresundhedskomplikationer, reduceret antal dyr, der kræves for at producere signifikante resultater, og større tillid til forsøgsresultater21,22. Tre metoder til administration af nye lægemidler er beskrevet i denne artikel til behandling af myokardieinfarkt i en svinemodel. Ved at specificere de anvendte teknikker og artikulere fordele og risici ved hver forventes det, at forskere komfortabelt vil være i stand til at skabe konsistente og pålidelige prækliniske modeller, der passer til deres forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Health and Medical Research Council APP1194139/APP1126276 (JC), National Stem Cell Foundation of Australia og New South Wales Government Office of Health and Medical Research (JC). DS blev støttet af Royal Australasian College of Physicians, Institute of Clinical Pathology and Medical Research og Australian Government Research Training Program. TD blev støttet af Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Penfolds Family Scholarship, National Health and Medical Research Council (APP2002783) og National Heart Foundation of Australia (104615).
Central line placement | |||
2-0 sutures | Ethicon | JJ9220 | |
Arrow' Paediatric Two-Lumen Central Venous Catheterisation Set with Blue FlexTip Catheter (contains 18G cook needle and 0.035" J-tip wire) | Teleflex | CS-14502 | Central Line |
Green Fluorsence Protein (GFP) | Abcam | ab13970 | 1:100 dilution ratio |
Histology antibodies | |||
Ku80 | Cell Signalling Technology | C48E7 | 1:500 dilution ratio |
No. 11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile ultrasound probe cover | Atris | 28041947 | |
Swine Jacket with Pocket, size 'Medium' | Lomir Biomedical | SS J2YJJET | |
Jugular vein osmotic minipump implantation | |||
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
Bellucci Self-Retaining Retractor | surgicalinstruments.net.au | group-24.26.02 | Self retaining tissue retractor |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel blade | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, 663G | |
Osmotic Infusion Minipump | Alzet | 2ML1, 2ML2, 2ML4 | |
Vascular Silicone Ties | Vecmedical | 95001 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | W9982 | |
Percutaneous transedocardial injection | |||
Artis Zee' C-Arm Fluoroscopy | Siemens | IR-19-1994 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Myostar' Injection Catheter | Biosense Webster | 121117S, 121119S, 1211120S | Intramyocardial injection catheter |
No.11 scalpel | Swann-Morton | 203 | |
Omnipaque' Iohexol Contrast | GE Healthcare | AUST R 39861 | Iodinated contrast agent |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sedation & general anaesthesia | |||
Compound Sodium Lactate Hartmann's Solution | Free flex | 894451 | |
Fentanyl 50 mcg/mL | Pfizer | AUST R 107027. | Intravenous anaesthesia and analgesia |
Forthane' Isoflurane | Abbott | AUST R 29656 | Inhalant anaesthetic |
GE Aestiva 5 Anaesthesia Machine | Datex Ohmeda | 17002-9, 17002A9 Avante Health Solutions | Anaesthetic Machine |
Hypnovel' Midazolam 5 mg/mL | Roche | AUST R 13726 | Sedative |
Intravenous cannula | BD Angiocath | 381137 | 20 gauge cannula |
Ketamil' Ketamine 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 51188c | Sedative |
Laryngoscope | Miller | VDI-6205 | |
Medetomidine 1 mg/mL | Ilium | APVMA number 64251; ACVM number A10488 | Sedative |
Metaraminol 10 mg/mL | Phebra | AUST R 284784 | Short-acting vasopressor |
Methadone 10 mg/mL | Ilium | APVMA number: 63712 | Sedative, Restricted drug |
Onsetron' Ondansetron 2 mg/mL | Accord Healthcare | AUST R 205593 | Anti-emetic |
Propofol-Lipuro' Propofol 10 mg/mL | Braun | AUST R 142906 | Intravenous anaesthetic |
Pulse Oximeter | Meditech | GVPMT-M3S | Portable pulse oximeter |
Shiley' Cuffed Basic Endotracheal Tube (Size 5.5 & 6.0) | Medtronic | 86108-, 86109- | |
Shiley' Intubating Stylet, 10 Fr | Medtronic | 85864 | |
Sodium Chloride 0.9% | Free flex | FAH1322 | |
Thoracotomy and epicardial Cell Injection | |||
27 G Insulin needle | Terumo | 51907 | |
Adson Brown Tissue Forceps | Icon Medical Supplies | KLINI316012 | |
CARTO' 3 System | Biosense Webster | Electrophysiological Mapping Software & System | |
Cefazolin 1 g Vial | AFT Pharmaceuticals | 9421900137367 CH2 | Antibiotic Prophylaxis |
Chest drainage tube | SurgiVet | SKU-336 | |
Cook Access Needle | Cook Medical | G07174 | Cannulation needle |
Cooley Sternotomy Retractor Paediatric | Millennium Surgical | 9-61287 | |
Durogesic' 100 mcg/h Fentanyl Patch | Janssen | AUST R 112371 | Postoperative analgesia |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Electrosurgical Pencils with 'Edge' Coated Electrodes | Covidien | E2450H | Cautery Pencil |
Fast-Cath' Introducer (6 French, 8 French) | Abbott | 406204, 406142 | Vascular sheath with introducer and guidewire |
Lignocaine 20 mg/mL | Pfizer | AUST R 49296, AUST R 49297, AUST R 49293 and AUST R 49295. | Local anaesthesia, anti-arrhythmic |
Marcaine' Bupivacaine 0.5% | Pfizer | AUST R 48328 | Local anaesthesia. |
Metzenbaum Scissors | Icon Medical Supplies | ARMO3250 | |
No. 22 scalpel | Swann-Morton | 208 | |
Nylon Suture (2-0, 3-0) | Ethicon | D9635, JJ76264 | |
Size 1 PDS suture | Ethicon | JJ75414 | |
Sparq' Ultrasound System | Philips | MP11742 Medpick | |
Sterile gauze | Kerlix | KE5072 | |
Sterile laparotomy sponges | Propax | 2907950 | |
Thermocool Smartouch' Catheter | Biosense Webster | D133601, D133602, D133603 | Epicardial Mapping Catheter |