Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması
Summary
Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Doğrudan nöronal yeniden programlama, multipotent ara ürünlerden geçmeden farklı başlangıç hücresi popülasyonlarından fonksiyonel nöronlar üretmek için güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknik, örneğin nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip hastalar için fibroblastları nöronlara dönüştürmeye izin verdiği için hastalık modellemesi alanında büyük vaatlerde bulunmakla kalmaz, aynı zamanda hücre bazlı replasman tedavileri için umut verici bir alternatifi temsil eder. Bu bağlamda, büyük bir bilimsel atılım, astrositler gibi merkezi sinir sistemi içindeki farklılaşmış nöral olmayan hücrelerin in vitro fonksiyonel nöronlara dönüştürülebileceğinin gösterilmesiydi. O zamandan beri, astrositlerin nöronlara in vitro doğrudan yeniden programlanması, zorla kimlik dönüşümünün altında yatan moleküler mekanizmalar ve verimli yeniden programlamayı önleyen engeller hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilen in vitro deneylerden elde edilen sonuçların, astrositleri izole etmek, kültürlemek ve yeniden programlamak için kullanılan yöntemlerdeki farklılıklar nedeniyle karşılaştırılması zordur. Burada, manyetik hücre sıralama yoluyla doğum sonrası yaşlarda farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden yüksek saflıkta astrositleri güvenilir bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, kültürlenmiş astrositleri viral transdüksiyon veya DNA transfeksiyonu yoluyla nöronlara yeniden programlamak için protokoller sağlıyoruz. Bu kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış protokol, hücre kimliğinin korunmasının altında yatan moleküler mekanizmaları, yeni bir nöronal kimliğin oluşturulmasını, ayrıca spesifik nöronal alt tiplerin üretimini ve fonksiyonel özelliklerini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Memeli merkezi sinir sistemi (CNS), çok sayıda farklı nöronal alt tip 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere yüzlerce farklı hücre tipinden oluşan oldukça karmaşıktır. Diğer organ veya dokularınaksine 7,8,9, memeli CNS çok sınırlı bir rejeneratif kapasiteye sahiptir; travmatik beyin hasarı veya nörodejenerasyon sonrası nöronal kayıp geri dönüşümsüzdür ve sıklıkla motor ve bilişsel eksikliklerle sonuçlanır10. Beyin fonksiyonlarını kurtarmayı amaçlayan, kayıp nöronları değiştirmek için farklı stratejiler yoğun bir araştırma altındadır11. Bunlar arasında, somatik hücrelerin fonksiyonel nöronlara doğrudan yeniden programlanması, umut verici bir terapötik yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır12. Doğrudan yeniden programlama veya transdiferansiyasyon, farklılaşmış bir hücre tipini, bir ara proliferatif veya pluripotent durumdan geçmeden yeni bir kimliğe dönüştürme işlemidir13,14,15,16. MyoD1’in fibroblastları kas hücrelerine dönüştürmek için yeterli bir faktör olarak tanımlanmasının öncülüğünü yaptığı bu yöntem, 19,20,21 19,20,21 gibi çeşitli hücre tiplerini yeniden programlamak için başarıyla uygulanmıştır.
CNS22,23’teki en bol makroglia olan astrositler, çeşitli nedenlerden dolayı doğrudan nöronal yeniden programlama için özellikle umut verici bir hücre tipidir. İlk olarak, CNS boyunca yaygın ve eşit olarak dağılırlar ve yeni nöronlar için bol miktarda in loco kaynağı sağlarlar. İkincisi, astrositler ve nöronlar, embriyonik gelişim sırasında ortak bir atayı paylaştıkları için gelişimsel olarak yakından ilişkilidir, radyal glial hücreler24. İki hücre tipinin ortak embriyonik kökeni, farklı germ katmanlarından hücrelerin yeniden programlanmasına kıyasla nöronal dönüşümü kolaylaştırıyor gibi görünmektedir19,21. Ayrıca, astrositler tarafından radyal glia kökenleri yoluyla miras alınan modelleme bilgisi, yetişkin astrositlerde de korunmaktadır 25,26,27 ve bölgesel olarak uygun nöronal alt tiplerin 28,29,30 oluşumuna katkıda bulunduğu görülmektedir. Bu nedenle, astrositlerin nöronlara dönüşümünü araştırmak ve anlamak, hücre bazlı değiştirme stratejileri için bu tekniğin tam potansiyelini elde etmenin önemli bir parçasıdır.
İn vitro kültürlü astrositlerin nöronlara dönüştürülmesi, doğrudan nöronal yeniden programlama alanında aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli atılımlara yol açmıştır: i) astrositlerden nöronlar üretmek için yeterli transkripsiyon faktörlerinin tanımlanması15,19,31, ii) aynı hücresel bağlamda farklı yeniden programlama faktörleri tarafından tetiklenen moleküler mekanizmalarınçözülmesi32 ve iii) astrositlerin gelişimsel kökeninin farklı nöronal alt tipleri indükleme üzerindeki etkisini vurgulamak28,29,33. Ayrıca, astrositlerin in vitro doğrudan dönüşümü, artan reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi 34 ve astrositlerin ve nöronların mitokondriyal proteomu arasındaki farklar 35 gibi doğrudan nöronal yeniden programlamayı sınırlayan birkaç büyük engeli çözmüştür 35. Bu nedenle, bu gözlemler, astrositlerin birincil kültürlerinin, biyoloji12’de, hücre kimliğinin korunması, hücre kaderi değişikliklerini önleyen barikatlar ve metabolizmanın yeniden programlamadaki rolü ile ilgili birkaç temel soruyu araştırmak için doğrudan nöronal yeniden programlama için bir model olarak kullanılmasını güçlü bir şekilde desteklemektedir.
Burada, astrositleri murin omuriliğinden izole ederek gösterildiği gibi, doğum sonrası (P) yaşta farelerden çok yüksek saflıkta astrositleri izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz29. Ayrıca astrositleri viral transdüksiyon veya DNA plazmid transfeksiyonu yoluyla nöronlara yeniden programlamak için protokoller sağlıyoruz. Yeniden programlanmış hücreler, yeniden programlama verimliliği ve nöronal morfoloji gibi çeşitli yönleri değerlendirmek için transdüksiyondan sonraki 7 günde (7 DPT) analiz edilebilir veya zamanla olgunlaşmalarını değerlendirmek için birkaç hafta boyunca kültürde tutulabilir. Önemli olarak, bu protokol omurilik astrositlerine özgü değildir ve astrositleri kortikal gri madde, orta beyin ve beyincik de dahil olmak üzere diğer çeşitli beyin bölgelerinden izole etmek için kolayca uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murin astrositlerinin birincil kültürleri, doğrudan nöronal yeniden programlamayı incelemek için dikkate değer bir in vitro model sistemidir. Aslında, doğum sonrası bir aşamada izole edilmiş olmalarına rağmen, hücreler tipik astrosit belirteçlerini 29 eksprese eder,28,29 model genlerinin ekspresyonunu korur vekarşılaştırılabilir bir 38 yaşında in vivo astrositlere benzer şekilde çoğalma kapasites…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yeniden programlama için yapıları klonladığı için Ines Mühlhahn’a, viral üretim için Paulina Chlebik’e ve el yazması hakkındaki yorumları için Magdalena Götz ve Judith Fischer-Sternjak’a teşekkür ederiz.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
Riferimenti
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
