Микроинъекция зиготы для создания генных кассетных нокаутных и флоксовых аллелей у мышей
Summary
Настоящий протокол описывает микроинъекцию зиготы CRISPR-Cas9 и донорской ДНК для эффективного получения генных кассетных и флоксированных мышей.
Abstract
Технология CRISPR-Cas позволила быстро и без усилий создать генетически модифицированных мышей. В частности, мыши и точечные мутантные мыши легко продуцируются путем электропорации факторов CRISPR (и одноцепочечных доноров олиго-ДНК) в зиготу. Напротив, генная кассета (>1 кб) нокаутированных и флоксированных мышей в основном генерируется путем микроинъекции факторов CRISPR и двухцепочечных доноров ДНК в зиготы. Технологии редактирования генома также повысили гибкость производства генетически модифицированных мышей. В настоящее время можно ввести предполагаемые мутации в целевые области генома в ряде полезных инбредных линий мышей. Наша команда произвела более 200 линий мышей с нокаутом с генными кассетами и более 110 линий мышей с флоксированием с помощью микроинъекции зиготы CRISPR-Cas9 по запросам из нескольких стран, включая Японию. В некоторых из этих методов редактирования генома использовались инбредные штаммы BALB/c, C3H/HeJ и C57BL/6N, однако в большинстве случаев использовался C57BL/6J. В отличие от метода электропорации, редактирование генома методом микроинъекции зиготы в различных инбредных штаммах мышей не так просто. Тем не менее, нокаутированные и флоксированные мыши на одном инбредном генетическом фоне так же важны, как и генетические гуманизированные, флуоресцентные репортерные и условно-нокаутные модели мышей. Таким образом, в данной статье представлен протокол микроинъекции зиготы CRISPR-факторов и двухцепочечных доноров ДНК у мышей C57BL/6J для генерации генных кассетных и флоксированных мышей. Эта статья посвящена исключительно ядерной инъекции, а не цитоплазматической инъекции. В дополнение к микроинъекции зиготы мы намечаем график производственного процесса и периферических методов, таких как индукция суперовуляции и перенос эмбрионов.
Introduction
Нокаутированные мыши, у которых предполагаемые экзогенные гены введены в целевые локусы, широко используются во многих исследованиях in vivo в качестве мышей с гуманизированным геном, флуоресцентных репортерных мышей и мышей-драйверов Cre 1,2. Когда нокаутные мутации индуцируются редактированием генома в зиготах мышей, в качестве донорской ДНКиспользуется одноцепочечная ДНК (одноцепочечные доноры олигоДНК, ssODN) или двухцепочечная ДНК (дцДНК 2,3). ssODN в основном используется для выбивания относительно коротких фрагментов генов менее 200.н. 4. С помощью длинных ssODN (lsODN)5,6 можно вбивать фрагменты ДНК длиннее 1 кб, однако их подготовка занимает много времени. При использовании доноров дцДНК можно получить генную кассету (>1 кб) мышей с нокаутом без трудоемкой подготовки донорской ДНК7.
Основное преимущество использования ssODN заключается в том, что электропорация8 может генерировать мышей с нокаутом. Однако доноры дцДНК должны быть введены непосредственно в ядро путем микроинъекции зиготы. Одновременный нокаут на двух участках требуется для создания флоксированных мышей, у которых каждая последовательность loxP выбивается вверх и вниз по течению от гена-мишени. Существует два способа получения флоксированных мышей путем редактирования генома в зиготах мышей: с использованием двух независимых ssODN, каждый из которых несет один сайт loxP, или с использованием одной дцДНК (или лсДНК) с флоксированной последовательностью; Первый очень неэффективен 9,10,11. Редактирование генома с использованием доноров дцДНК является простейшим подходом к получению генных кассетных и флоксированных мышей, если окружающая среда благоприятствует микроинъекции зиготы.
Первоначально смеси мРНК Cas9 и sgRNA или векторы ДНК, кодирующие sgRNA и Cas9, используются для редактирования генома в зиготахмышей 12,13. Поскольку высококачественные и стабильные белки Cas9 теперь доступны по низкой цене, введение рибонуклеопротеина (РНП) крРНК-тракрРНК-Cas9 в зиготымыши 14 стало популярным. В последнее время нок-ин-мыши были получены с высокой эффективностью путем введения крРНК-тракрРНК-Cas9 РНП и донорской ДНК в оба пронуклеуса зигот мышей в фазе клеточного цикла, где наиболее вероятно произойдет нокаутирование15. Таким образом, в настоящем протоколе описываются способы получения различных типов мышей с нокаутом с помощью этого способа.
Существует много полезных инбредных линий лабораторных мышей16. Генетическая модификация в рамках инбредного фона может игнорировать влияние генетического фона на фенотип. В данной статье описывается метод индуцирования нокаутных и флоксированных мутаций в зиготе наиболее часто используемой инбредной линии мышей C57BL/6J17. Кроме того, также обсуждаются сроки создания генетически модифицированных мышей и используемые периферические методы, включая индукцию суперовуляции и перенос эмбрионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании свежие (не замороженные-размороженные) мышиные зиготы C57BL/6J, полученные в результате естественного спаривания, использовались для редактирования генома мышиного производства. Путем инъекции crRNA-tracrRNA-Cas9 и донорской ДНК (RNPD) в оба пронуклеуса этих зигот в фазе клеточного цикла, где наиболее вероятно нокаутирование, были получены мыши с кассетой генов и флоксированными мышами с высокой рождаемостью и достаточной эффективностью редактирования генома. Настоящее исследование усиливает расширяемость метода SPRINT-CRISPR15, где он обеспечивает достаточную эффективность нокаута даже в генетическом фоне C57BL / 6J и может быть применен для получения флоксированных мышей.
Электропорация является высоко обобщенным методом получения мышей с отредактированным геномом из-за низкой стоимости экспериментальных устройств и простоты изучения техники8. Кроме того, метод19 i-GONAD, в котором редактирование генома выполняется с помощью преимплантационных эмбрионов, существующих в яйцеводе, не требует мыши-реципиента. По сравнению с этими методами, представленный здесь метод является дорогостоящим и трудоемким при подготовке и обслуживании экспериментальной среды с точки зрения как аппаратного, так и программного обеспечения. Однако, как только экспериментальные установки будут созданы, сложные мыши с нокаутом генных кассет и флоксированные мыши могут быть получены только с коммерчески доступными элементами CRISPR (крРНК, тракрРНК и белок Cas9) и простым, небольшим количеством кольцевого плазмидного вектора, который будет использоваться в качестве донорской ДНК. Это означает, что многие сложные линии мышей с отредактированным геномом могут быть получены без необходимости подготовки трудоемких (или относительно дорогих) lsODN 5,6 или аденоассоциированных вирусных векторов20.
В отличие от оригинального метода SPRINT-CRISPR15, использовались свежие (замороженные-размороженные) зиготы. При получении свежих зигот путем естественного спаривания можно игнорировать технические ошибки, которые могут возникнуть при экстракорпоральном оплодотворении или замораживании и размораживании. Кроме того, процесс манипуляций с эмбрионом может быть завершен примерно за полдня (рис. 1) в соответствии с текущим подходом. С другой стороны, некоторые ограничения настоящего способа включают в себя требования к большому количеству мышей-самцов, свободный контроль времени оплодотворения и ограниченную способность полностью предсказывать количество зигот для микроинъекций. По сравнению с оригинальным методом SPRINT-CRISPR, этот метод может иметь более высокий уровень рождаемости (табл. 1). Несмотря на это, нельзя сделать вывод, что данный метод лучше с точки зрения рождаемости из-за различий в проводниках эксперимента, генах-мишенях, генетических фонах и сроках подтверждения эмбрионов.
Как показано в таблице 1, большое количество мышей в большинстве проектов нокаутирования генных кассет имели случайные аллели интеграции. Случайная интеграция должна быть устранена, потому что она может привести к непреднамеренному нарушению эндогенных генов и эктопической экспрессии трансгенов. Задача на будущее состоит в том, чтобы найти экспериментальные условия, которые уменьшат количество случайных событий интегрирования, сохраняя при этом достаточную эффективность докаутирования.
Почти все редактирование генома зиготы мыши с использованием эффекторов редактирования генома, которые приводят к двухцепочечным разрывам ДНК, вероятно, индуцирует непреднамеренные мутации на целевых участках 9,21. Результаты этих непреднамеренных мутаций-мишеней здесь не описаны, потому что мы не находимся в ситуации, в которой можно управлять следующим поколением мышей, чтобы представить четкие доказательства их существования. Лучший способ исключить беспокойство по поводу путаницы, вызванной непреднамеренным мутагенезом на мишени, – это получить следующее поколение мышей путем спаривания основателей с мышами дикого типа, а не путем скрещивания основателей. В принципе, мыши N1, полученные в результате этого скрещивания, относятся к дикому типу (WT) на одной стороне аллеля, поэтому, если обнаружен предполагаемый аллель нокаута (KI), они гетерозиготны WT/KI. Таким образом, целевой мутагенез не является критической проблемой у лабораторных мышей, которые имеют относительно быстрый жизненный цикл и являются плодовитым животным. Тем не менее, дальнейшее совершенствование будет необходимо, когда эта технология будет применена к относительно крупным млекопитающим.
Было подтверждено, что эта технология может производить мышей с нокаутом генов в инбредных штаммах, отличных от C57BL / 6J, но достаточное количество проектов не защищено, и данные сильно варьируются. По этой причине данная информация не включена в настоящее исследование. Считается, что дальнейшие исследования по этому вопросу будут необходимы для продвижения генетики мышей и исследований моделей заболеваний.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана научными исследованиями (B) (19H03142: к SM), научными исследованиями (A) (20H00444: к FS), научными исследованиями (A) (21H04838: к SM) и научными исследованиями по инновационным направлениям «Платформа поддержки передовых моделей животных» (16H06276: к ST) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарны Рёити Мори за его полезную дискуссию о дизайне редактирования генома.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
Riferimenti
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
