생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

모든 동물 실험은 쓰쿠바 대학 동물 실험 규정 및 교육부 소관 학술 연구 기관의 동물 실험 및 관련 활동의 적정한 수행에 관한 기본 지침에 따라 쓰쿠바 대학 기관 동물 실험위원회의 승인을 받아 인도적으로 수행되었으며, 일본의 문화, 스포츠, 과학, 기술. 10-25주령의 남녀 C57BL/6J 마우스를 접합체 기증자로 사용했습니다. ICR 마우스(10주령 이상)를 수용자 마우스로 사용하였다. 마우스는 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조). 1. cell-free 시스템에서 crRNA 절단 활성 확인 2 nmol의 crRNA(건조) 및 20 nmol의 tracrRNA(건조)를 각각 25 μL 및 250 μL의 RNase-free water에 용해시킨다( 재료 표 참조).참고: 절단 활성이 높고 가능한 한 적은 off-target을 가질 것으로 예측된 CRISPR 표적 서열은 CRISPOR를 사용하여 선택됩니다( 재료 표 참조). 유전자 카세트 knock-in의 경우, 삽입 부위를 가로질러 서열을 표적으로 한다. 플록싱할 엑손은 KOnezumi를 사용하여 선택되었습니다( 재료 표 참조). 표적 부위를 포함하는 DNA 단편(약 0.5-1 kb)을 게놈 PCR9로 증폭한다. 이 PCR 앰플리콘을 일반적인 PCR 산물 추출 키트로 정제합니다( 재료 표 참조). 10 μL의 CRISPR 혼합물을 준비합니다(Cas9 뉴클레아제 반응 완충액에 100 ng/μL의 crRNA, 150 ng/μL의 tracrRNA, 1 ng/μL의 Cas9, 재료 표 참조). CRISPR-Cas9 복합체를 구성하려면 CRISPR 혼합물을 37°C의 열 블록에 30분 동안 넣습니다. CRISPR 혼합물의 총 부피(10μL)를 1.2단계에서 설명한 PCR 산물(10μL, 20ng/μL)에 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 전기영동 중에 RNA가 없어야 하므로 1μL의 RNase(500ng/μL)를 추가하여 37°C에서 30분 동안 crRNA와 tracrRNA를 분해합니다. 소듐 도데실 설페이트(2% w/v)를 함유한 로딩 염료를 사용하여 위 샘플의 전기영동을 수행합니다.참고: 드물게 절단 활성이 없는 crRNA가 관찰됩니다. 이러한 경우 게놈 편집 디자인을 다시 설계하는 것이 좋습니다. 2. 접합체 미세주입을 위한 crRNA, tracrRNA, Cas9 단백질 및 donor DNA의 혼합물 준비 CRISPR 용액(RNase가 없는 물에서 crRNA 50ng/μL, tracrRNA 200ng/μL, Cas9 200ng/μL)을 준비합니다. 기증자 DNA 용액(자가 구성된 플라스미드 DNA 벡터 20ng/μL)을 준비합니다.공극 크기가 0.22μm인 멸균 주사기 필터를 통해 기증자 DNA 용액을 여과합니다. 동일한 부피의 CRISPR 용액과 여과된 기증자 DNA 용액을 혼합합니다. 각각의 최종 농도가 crRNA 25ng/μL, tracrRNA 100ng/μL, Cas9 100ng/μL, donor DNA 10ng/μL인지 확인합니다. 이 혼합물은 이후 RNPD로 지칭될 것이다.참고: 플록스 마우스 생산 중과 같이 두 부위를 절단할 때 각 crRNA의 농도는 25ng/μL이어야 합니다. 공여자 DNA는 원형 플라스미드 DNA이며 일반적인 미니 분취 스핀 컬럼 키트로 정제할 수 있습니다( 재료 표 참조). 준비된 용액은 얼음 위에 놓고 가능한 한 빨리 미세 주입에 사용해야합니다. 3. 자연 교배를 통한 생쥐 접합체 얻기 5IU의 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG, 재료 표 참조)을 미세주입 3일 전에 C57BL/6J 암컷 마우스(10-25주령)에 피하 주사합니다. 약 46-48시간 후, 5IU의 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG, 재료 표 참조)을 복강 내 투여합니다. PMSG 및 hCG 처리된 암컷 마우스를 수컷 C57BL/6J 마우스와 함께 수용하고 다음날 아침 질 플러그를 확인합니다.참고: 암컷 C57BL/6J 마우스 한 마리에서 약 15-25개의 접합체를 얻을 수 있습니다. 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2와 같이 접합체 배양을 위한 35mm 페트리 접시 2개를 준비합니다. 사용할 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣습니다. 이들은 밤새 보관할 수 있습니다. 자궁 경부 탈구에 의해 질 플러그가 확인 된 암컷 마우스를 안락사시키고 작은 가위를 사용하여 복부 피부와 근육층을 통해 하복부 정중선에서 갈비뼈 아래까지 절개합니다.참고: 안락사에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권고를 따르십시오. 난관을 모아 페트리 접시 뚜껑에 0.75mg/mL의 히알루로니다아제( 재료 표 참조)가 들어 있는 M20 배지 20μL 방울에 넣습니다. 미세한 팁 집게로 하나의 난관을 집어 들고 fimbriae를 통해 히알루로니다아제가 포함된 약 50μL의 M2 배지를 관류합니다.참고: 이때 접합체는 수많은 난운 세포로 느슨하게 둘러싸여 있습니다. 30 초 후, 유리 모세관을 사용하여 소량의 배지로 형태 학적으로 정상적인 접합체를 집어 들고 신선한 M16 배지 방울로 옮겨 세척합니다. 세척된 접합체를 풀링을 위해 페트리 접시(그림 2)로 옮깁니다.참고: 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 형태학적으로 정상적인 접합체는 암수 전핵과 구형을 심각하게 손상시키지 않은 두 개의 극체를 가지고 있다15. 접합체의 형태는 균주와 종에 따라 상당히 다릅니다. 모든 접합체가 검색될 때까지 3.3단계와 3.4단계를 반복합니다. 약 100개의 접합체가 배양 접시의 M16 한 방울에 모일 수 있습니다. 미세주입될 때까지 접시를 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 보관한다. 4. 미세주사바늘의 제조 프로그래밍 가능한 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 당깁니다( 재료 표 참조).알림: 미세 주입 바늘은 끝이 얇고 테이퍼가 길어야 합니다. 풀러에 세포질 내 정자 주입을 위한 바늘을 만드는 프로그램이 있는 경우 동일한 프로그램을 사용하여 미세 주입용 바늘을 만들 수 있습니다. 마이크로 포지 팁에 부착 된 유리 볼을 쳐서 미세 주입 바늘의 끝을 부러 뜨립니다. 미세 주입 바늘의 팁 크기가 직경이 약 1μm인지 확인하십시오. 팁 크기를 현미경으로 1000x 배율로 확인합니다. 마이크로 포지를 사용하여 팁에서 약 2-3mm에서 미세 주입 바늘을 구부립니다.알림: 굽힘 각도는 마이크로 매니퓰레이터의 설정에 따라 다릅니다. 너무 많이 구부리면 피에조 펄스의 효율성이 감소합니다. 5. 접합체 미세주입 1-1.5 cm의 수술액(수은의 대안으로 구멍을 뚫기 위해 피에조 효과에 필요한 관성체, 재료 표 참조)을 미세 주입 바늘의 중앙에 주입하고 피에조 액추에이터가 있는 수동 미세 주입기 홀더에 부착합니다.또한 고정 바늘을 반대쪽 수동 마이크로 인젝터 홀더에 부착합니다. 점진적인 압력으로 수술액을 미세 주입 바늘 끝으로 이동합니다. 마이크로 매니퓰레이터에 수동 마이크로 인젝터 홀더를 모두 고정합니다.알림: 미세주입 바늘 끝에서 나오는 수술액은 현미경으로 50배 배율로 관찰할 수 있습니다. 방출되는 액체의 양을 조정한 후 피에조 펄스가 적용될 때 액체가 튀는 것을 관찰하여 피에조 펄스가 효과적임을 확인할 수 있습니다. 이것이 확인되지 않으면 미세 주입 바늘을 다시 준비하십시오. 3개의 액적을 갖는 주입 챔버를 준비한다: (1) 10 μL의 M2 배지; (2) M2 배지 중 12% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 5μL; 및 (3) crRNA, tracrRNA, Cas9 단백질 및 Donor DNA(RNPD) 용액의 5μL 혼합물. 3.2단계와 동일한 방식으로 물방울을 미네랄 오일로 덮고 주입 챔버를 도립 현미경 스테이지에 설정합니다.50x 배율의 도립 현미경에서 미세 주입 피펫을 12% PVP 방울로 내립니다. 12% PVP를 흡인 및 분주하여 미세주입 바늘 끝 내부를 청소하고 RNPD 방울로 옮깁니다. 수동 미세 주입기를 음압에 놓고 RNPD 용액을 미세 주입 바늘로 빨아들입니다. 충분한 양이 흡인될 때까지 몇 분 동안 기다리십시오. 현미경으로 50배 확대하여 미세주입 바늘 내부 전체를 액체로 채웁니다.흡입을 중지하고 수동 마이크로 인젝터를 양압으로 설정하여 RNPD 용액이 서서히 배출되도록합니다. 미세 주입 바늘의 끝을 오일로 옮깁니다.알림: 흡입을 위해 수동 마이크로 인젝터의 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 흡입을 멈추려면 손잡이를 시계 방향으로 돌리고 현미경으로 관찰하면서 점차적으로 압력을 높입니다. RNPD 용액은 점차적으로 배출됩니다. 미세 주입 바늘의 액체 레벨 이동을 통해 유출을 확인할 수 있습니다. M2 방울에 접합체 50개를 넣고 홀딩 피펫을 같은 방울로 부드럽게 내립니다. 접합체가 포함된 M2 방울에 미세주입 바늘을 옮깁니다. 20x 대물렌즈로 전환하고 미세주입 파이펫의 팁에 초점을 맞춥니다.참고: 10분 안에 주입할 수 있는 접합체를 최대한 많이 넣습니다. 접합체를 잡고 미세 조작기를 움직여 전핵에 초점을 맞춥니다. 미세 주입 바늘을 접합체에 삽입하고 팁을 전핵에 가깝게 가져옵니다. 팁이 전핵막에 도달하면 피에조 펄스(강도: 6-10, 속도: 1)를 적용하여 피어싱합니다.미세주사바늘이 전핵에 구멍을 뚫으면 RNPD 용액을 주입하고 전핵의 부종을 관찰한다. 전핵이 완전히 부풀어 오르면 바늘을 빨리 빼냅니다. 암컷과 수컷 전핵 모두에서 동일한 절차를 수행하십시오.참고: 주사에 의한 전핵의 팽창은 현미경으로 명확하게 볼 수 있습니다. 이러한 인플레이션의 정도는 말로 표현하기 어렵지만, 이전 보고서(15)를 참조하여 확인할 수 있다. 주입된 접합체를 M2 방울 내의 다른 위치로 이동하여 주입 전후의 접합체를 식별합니다. M2 방울의 모든 접합체가 주입될 때까지 5.5-5.6단계를 반복합니다. 주사 후 접합체를 신선한 M16 접시에 옮깁니다. 주사 후 10분 후에 생존한 접합체를 선택합니다. 주입에 의해 손상된 용해된 접합체를 제거하고 살아남은 접합체를 M16 접시의 각 방울에 분배합니다. 각 물방울은 한 명의 가임신 여성에 대해 20-24 개의 접합체를 포함해야합니다. 이렇게 하면 M16 접시가 배아 이식 중에 인큐베이터 외부 환경에 노출되는 시간이 줄어듭니다.참고: 최적의 주사 조건에서 생존율은 90%-95%입니다. 이것은 바늘 끝의 크기, 피에조 펄스의 강도 및 RNPD 용액의 유출 압력에 따라 다릅니다. 6. 난관으로의 배아 이식 가임신한 마우스를 얻으려면 발정 단계에 있는 각 암컷 ICR 마우스를 혈관 연결된 수컷 ICR 마우스와 교배합니다. 다음날 플러그를 확인하십시오.참고 : 20 쌍의 짝짓기에서 약 15 마리의 가임신 마우스를 얻습니다. 세 가지 유형의 혼합 마취제(메데토미딘 0.2mg/kg, 미다졸람 4.0mg/kg, 부토르파놀 2.5mg/kg, 재료 표 참조)를 가임신한 암컷 마우스에 피하 투여합니다. 호흡수의 감소와 꼬리 핀치 및 뒷다리 페달 철수 반사의 소실로 적절한 마취를 확인하십시오. 지역 동물 윤리 위원회의 권고에 따라 눈에 윤활유를 바르기 위해 안과용 연고를 바르십시오. 엎드린 자세로 마우스의 등쪽 부위를 면도날로 면도하고 수술 부위를 세 번 소독한 후 요오드 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 작은 해부 가위로 척추를 따라 약 1cm 정도 등쪽 피부를 절개합니다. 등쪽 절개 상처를 복부로 한쪽으로 옮기고 난소가 보이는 근육층을 절개하고 핀셋으로 난소 위의 지방을 잡고 난소, 난관, 자궁을 빼냅니다.serrefine 클램프로 지방을 고정하십시오( 재료 표 참조). 생식 조직을 멸균 거즈에 올려 코트와 직접 접촉하지 않도록하십시오. 다음 순서로 소량의 배양 배지(M2 또는 M16), 약간의 기포를 마커로 배치하고 이식을 위해 접합체를 피펫에 넣습니다.참고: 난관당 약 10-12개의 접합체를 이식합니다. 팽대부와 난관의 섬유질 사이에 미세 전단( 재료 표 참조)을 사용하여 절개하고(유리 피펫이 들어갈 수 있을 만큼만 길게) 접합체를 절개 부위에 도입하고 동시에 기포가 도입되었는지 확인합니다. 다른 난관에 이식을 유사하게 수행하십시오 (6.6 단계). 자동 클립으로 외부 피부를 봉합하십시오( 재료 표 참조).참고: 절개 상처가 불가피하게 크지 않는 한 절개된 근육층을 봉합하지 마십시오. 절개 된 근육층의 이상적인 크기는 2-3mm 미만이어야합니다. 절개 부위가 5mm보다 크면 멸균 된 봉합사 바늘과 실을 사용하여 근육층을 봉합해야합니다 ( 재료 표 참조). 7. 동물 회복 아티파메졸 염산염(0.3 mg/kg)을 생쥐에게 피하 투여한다.참고: 수술 후 진통에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권장 사항을 따르십시오. 그런 다음 마우스를 케이지에 넣고 37°C의 핫플레이트에서 따뜻하게 유지합니다. 생쥐가 깨어 난 후 약 2 시간 동안 따뜻하게 유지하십시오. 생쥐의 비정상적인 행동이 없음을 확인한 후 케이지를 사육장에 다시 넣습니다.