Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Alle dierproeven werden humaan uitgevoerd met goedkeuring van de Institutionele Dierproefcommissie van de Universiteit van Tsukuba, volgens de Voorschriften voor Dierproeven van de Universiteit van Tsukuba en de Fundamentele Richtlijnen voor Goed Verloop van Dierproeven en aanverwante Activiteiten in Academische Onderzoeksinstellingen onder de jurisdictie van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan. C57BL/6J muizen van beide geslachten, 10-25 weken oud, werden gebruikt als de zygote donor. ICR-muizen (ouder dan 10 weken) werden gebruikt als de ontvangende muizen. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). 1. Bevestiging van crRNA-splitsingsactiviteit in een celvrij systeem Los 2 nmol crRNA (droog) en 20 nmol tracrRNA (droog) op in respectievelijk 25 μL en 250 μL RNasevrij water (zie tabel met materialen).OPMERKING: CRISPR-doelsequenties waarvan werd voorspeld dat ze een hoge splitsingsactiviteit hadden en zo min mogelijk off-targets, worden geselecteerd met CRISPOR (zie Materiaaltabel). In het geval van een gencassette knock-in, richt u de sequentie op de inbrengplaats. De te floxen exon(en) werden geselecteerd met behulp van de KOnezumi (zie Materiaaltabel). Amplificeer het DNA-fragment (ongeveer 0,5-1 kb) dat de doellocatie bevat met genomische PCR9. Zuiver dit PCR-amplicon met de gebruikelijke PCR-productextractiekit (zie materiaaltabel). Bereid 10 μL CRISPR-mengsel (100 ng/μL crRNA, 150 ng/μL tracrRNA en 1 ng/μL Cas9 in de Cas9 Nuclease-reactiebuffer, zie Tabel met materialen). Om het CRISPR-Cas9-complex te construeren, plaatst u het CRISPR-mengsel gedurende 30 minuten in een warmteblok bij 37 °C. Voeg het totale volume (10 μL) CRISPR-mengsel toe aan het PCR-product (10 μL, 20 ng/μL) zoals beschreven in stap 1.2 en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Voeg 1 μL RNase (500 ng/μL) toe om het crRNA en tracrRNA gedurende 30 minuten bij 37 °C af te breken, aangezien RNA’s afwezig moeten zijn tijdens elektroforese. Voer elektroforese uit van de bovenstaande monsters met behulp van een ladingskleurstof die natriumdodecylsulfaat bevat (2% w / v).OPMERKING: In zeldzame gevallen worden crRNA’s zonder splitsingsactiviteit waargenomen. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om het ontwerp voor genoombewerking opnieuw te ontwerpen. 2. Bereiding van het mengsel van crRNA, tracrRNA, Cas9-eiwit en donor-DNA voor zygote micro-injectie Bereid CRISPR-oplossing (50 ng/μL crRNA, 200 ng/μL tracrRNA en 200 ng/μL Cas9 in RNase-vrij water). Bereid een donor-DNA-oplossing (20 ng/μl zelfgeconstrueerde plasmide-DNA-vector).Filter de donor-DNA-oplossing door een steriele spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm. Meng gelijke volumes CRISPR-oplossing en gefilterde donor-DNA-oplossing. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van elk 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μl tracrRNA, 100 ng/μl Cas9 en 10 ng/μl donor-DNA is. Dit mengsel wordt hierna RNPD genoemd.OPMERKING: Bij het snijden van twee locaties, zoals tijdens de productie van floxed muizen, moet de concentratie van elk crRNA 25 ng / μL zijn. Het donor-DNA is een circulair plasmide-DNA en kan worden gezuiverd met een gewone mini-prep spin column kit (zie Tabel van Materialen). De bereide oplossing moet zo snel mogelijk op ijs worden geplaatst en voor micro-injectie worden gebruikt. 3. Het verkrijgen van muizen zygoten door natuurlijke paring Injecteer 5 IE serumgonadotrofine (PMSG, zie tabel met materialen) subcutaan in C57BL/6J vrouwelijke muizen (10-25 weken oud) 3 dagen vóór micro-injectie. Dien ongeveer 46-48 uur later 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG, zie tabel met materialen) intraperitoneaal toe. Combineer de PMSG- en hCG-behandelde vrouwelijke muizen met mannelijke C57BL/6J-muizen en controleer de vaginale pluggen de volgende ochtend.OPMERKING: Ongeveer 15-25 zygoten kunnen worden verkregen van één vrouwelijke C57BL / 6J-muis. De tijdlijn is weergegeven in figuur 1. Bereid twee petrischalen van 35 mm voor de zygotecultuur, zoals weergegeven in figuur 2. Plaats ze in de incubator (37 °C, 5% CO2) voor gebruik. Deze kunnen ‘s nachts worden opgeslagen. Euthanaseer de vrouwelijke muizen met bevestigde vaginale pluggen door cervicale dislocatie en snijd met een kleine schaar door de buikhuid en spierlaag vanaf de middellijn van de onderbuik tot onder de ribben.OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren voor euthanasie. Verzamel de eileiders en plaats ze in een druppel M2-medium van 20 μL met 0,75 mg/ml hyaluronidase (zie materiaaltabel) op het deksel van de petrischaal. Pak een eileider met een fijne punttang en perfuseer ongeveer 50 μL M2 medium met hyaluronidase door de fimbriae.OPMERKING: Op dit moment zijn de zygoten losjes omgeven door talrijke cumuluscellen. Pak na 30 s morfologisch normale zygoten op met een kleine hoeveelheid medium met behulp van een glazen capillair en was ze door ze over te brengen naar verse M16 middelgrote druppels. Breng de gewassen zygoten over in een petrischaaltje (figuur 2) om te poolen.OPMERKING: De tijdlijn wordt weergegeven in figuur 1. Morfologisch normale zygoten hebben een mannelijke en vrouwelijke pronucleus en twee polaire lichamen die de bolvorm niet ernstig hebben aangetast15. De morfologie van de zygote varieert aanzienlijk tussen stammen en soorten. Herhaal stap 3.3 en 3.4 totdat alle zygoten zijn opgehaald. Ongeveer 100 zygoten kunnen worden samengevoegd in één M16-druppel in de kweekschaal. Bewaar de schaal in de couveuse (37 °C, 5% CO2) tot micro-injectie. 4. Bereiding van de micro-injectienaald Trek aan enkele glazen pipetten met behulp van de programmeerbare pipettrekker (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Microinjectienaalden moeten een dunne punt en lange taps toelopende naalden hebben. Als de trekker een programma heeft voor het maken van naalden voor intracytoplasmatische sperma-injectie, kan hetzelfde programma worden gebruikt om naalden voor micro-injectie te maken. Breek de punt van de microinjectienaald door op de glazen bol te slaan die aan de microsmederijpunt is bevestigd. Zorg ervoor dat de tipgrootte van de micro-injectienaald ongeveer 1 μm in diameter is. Controleer de tipgrootte onder een microscoop bij 1000x vergroting. Buig de microinjectienaald op ongeveer 2-3 mm van de punt met behulp van een microforge.OPMERKING: De hoek van de bocht is afhankelijk van de opstelling van de micromanipulator. Te veel buigen zal de effectiviteit van de piëzopuls verminderen. 5. Zygote micro-injectie Injecteer 1-1,5 cm van de operatievloeistof (traagheidslichaam dat nodig is voor het piëzo-effect om gaten te maken als alternatief voor kwik, zie Tabel met materialen) in het midden van de microinjectienaald en bevestig deze aan de handmatige micro-injectorhouder met de piëzo-actuator.Bevestig verder de houdnaald aan de tegenoverliggende handmatige micro-injectorhouder. Verplaats de operatievloeistof met geleidelijke druk naar de punt van de microinjectienaald. Bevestig beide handmatige micro-injectorhouders op de micromanipulator.OPMERKING: De operatievloeistof die uit de punt van de microinjectienaald komt, kan onder een microscoop worden waargenomen bij een vergroting van 50x. Na het aanpassen van de hoeveelheid uitgestoten vloeistof, kan het spatten van vloeistof worden waargenomen wanneer de piëzopulsen worden toegepast, wat bevestigt dat de piëzopulsen effectief zijn. Als dit niet kan worden bevestigd, bereidt u de microinjectienaald opnieuw voor. Bereid een injectiekamer met drie druppels: (1) 10 μL M2-medium; (2) 5 μl 12% polyvinylpyrrolidon (PVP) in M2-medium; en (3) een mengsel van 5 μL van crRNA, tracrRNA, Cas9-eiwit en de donor-DNA (RNPD) oplossing. Bedek de druppels met minerale olie op dezelfde manier als stap 3.2 en zet de injectiekamer op het omgekeerde microscoopstadium.Laat onder de omgekeerde microscoop bij een vergroting van 50x de micro-injectiepipet in de 12% PVP-druppel zakken. Zuig en doseer 12% PVP om de binnenkant van de micro-injectienaaldpunt te reinigen en over te brengen naar de RNPD-druppel. Plaats de handmatige micro-injector onder negatieve druk en zuig de RNPD-oplossing op in de microinjectienaald. Wacht een paar minuten totdat er voldoende volume is aangezogen; Vul onder een microscoop die 50x is vergroot de hele binnenkant van de microinjectienaald met vloeistof.Stop de inname en laat de RNPD-oplossing geleidelijk worden verdreven door de handmatige micro-injector op positieve druk in te stellen. Beweeg de punt van de microinjectienaald in de olie.OPMERKING: Draai de knop van de handmatige micro-injector tegen de klok in voor inhalatie. Om de inademing te stoppen, draait u de knop met de klok mee en verhoogt u geleidelijk de druk terwijl u onder een microscoop observeert. De RNPD-oplossing zal geleidelijk worden afgevoerd. Beweging van het vloeistofniveau in de micro-injectienaald maakt bevestiging van de uitstroom mogelijk. Doe 50 zygoten in de M2-druppel en laat de bevestigingspipet voorzichtig in dezelfde druppel zakken. Breng de microinjectienaald over in de M2-druppel met zygoten. Schakel over naar een 20x objectief en focus op de punt van de micro-injectiepipet.OPMERKING: Plaats zoveel mogelijk zygoten die in 10 minuten kunnen worden geïnjecteerd. Houd een zygote vast en concentreer je op de pronucleus door de micromanipulator te bewegen. Steek de microinjectienaald in de zygote en breng de punt dicht bij de pronucleus. Zodra de punt het pronucleusmembraan bereikt, brengt u de piëzopuls (intensiteit: 6-10, snelheid: 1) aan om te doorboren.Wanneer de micro-injectienaald de pronucleus doorboort, injecteert u de RNPD-oplossing en observeert u de zwelling van de pronucleus. Zodra de pronucleus volledig is opgeblazen, trekt u de naald er snel uit. Voer dezelfde procedure uit op zowel de vrouwelijke als de mannelijke pronuclei.OPMERKING: De inflatie van de pronucleus door injectie is duidelijk te zien onder de microscoop. De mate van deze inflatie is moeilijk te verwoorden, maar kan worden bevestigd door te verwijzen naar eerdere rapporten15. Verplaats de geïnjecteerde zygote naar een andere locatie in de M2-druppel om de zygoten voor en na injectie te identificeren. Herhaal stap 5.5-5.6 totdat alle zygoten in de M2-druppel zijn geïnjecteerd. Breng na de injectie de zygoten over in een verse M16-schaal. Selecteer de overleefde zygoten 10 min na injectie. Verwijder de gelyseerde zygoten die door de injectie zijn beschadigd en verdeel overlevende zygoten naar elke druppel in de M16-schaal. Elke druppel moet 20-24 zygoten bevatten voor één pseudopregnant vrouwtje. Dit vermindert de tijd dat de M16-schotel wordt blootgesteld aan de omgeving buiten de couveuse tijdens de embryotransfer.OPMERKING: Onder optimale injectieomstandigheden is de overlevingskans 90% -95%. Dit is afhankelijk van de grootte van de naaldpunt, de sterkte van de piëzopuls en de uitstroomdruk van de RNPD-oplossing. 6. Embryotransfer in de eileider Voor het verkrijgen van pseudopregnant muizen, paren elke vrouwelijke ICR-muis in de proestrusfase met een gevasoligeerde mannelijke ICR-muis. Controleer de stekkers de volgende dag.OPMERKING: Ongeveer 15 pseudopregnant muizen worden verkregen uit 20 paringparen. Dien drie soorten gemengde anesthetica (0,2 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg midazolam en 2,5 mg/kg butorfanol, zie tabel met materialen) subcutaan toe aan de pseudopregnant vrouwelijke muizen. Bevestig de juiste anesthesie door een afname van de ademhalingsfrequentie en het verdwijnen van de ontwenningsreflexen van de staart en het achterste pedaal. Breng oogheelkundige zalf aan om de ogen te smeren volgens de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren. Na het scheermesscheren van het dorsale gebied van de muis in buikligging en het desinfecteren van het chirurgische gebied drie keer, afwisselend tussen een scrub op basis van jodium of chloorhexidine en alcohol, snijdt u de dorsale huid ongeveer 1 cm langs de wervelkolom in met een kleine ontleedschaar. Verplaats de dorsale incisiewond naar één kant ventraal, snijd de spierlaag in waardoor de eierstok kan worden gezien, grijp het vet boven de eierstok met een pincet en trek de eierstok, eileider en baarmoeder terug.Zet het vet vast met een serrefineklem (zie Materiaaltabel). Plaats de voortplantingsweefsels op steriel gaas om direct contact met de vacht te voorkomen. Plaats in de volgende volgorde een kleine hoeveelheid kweekmedium (M2 of M16), enkele luchtbellen als marker en de zygoten in een pipet voor overdracht.OPMERKING: Breng ongeveer 10-12 zygoten per eileider over. Maak een incisie met behulp van een microschuiving (zie materiaaltabel) tussen de ampulla en de fimbriae van de eileider (net lang genoeg om de glazen pipet binnen te laten), breng de zygoten in de incisie en bevestig tegelijkertijd dat de luchtbel is ingebracht. Voer de implantatie in de andere eileider op dezelfde manier uit (stap 6.6). Hecht de buitenste huid vast met autoclips (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Hecht de ingesneden spierlaag niet tenzij de incisiewond onvermijdelijk groot is. De ideale grootte van de ingesneden spierlaag moet minder dan 2-3 mm zijn. Als de incisie groter is dan 5 mm, moet de spierlaag worden gehecht met behulp van een gesteriliseerde hechtnaald en draad (zie tabel met materialen). 7. Herstel van dieren Dien atipamezolhydrochloride (0,3 mg/kg) subcutaan toe aan muizen.OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren voor postoperatieve analgesie. Plaats de muizen vervolgens in kooien en houd ze warm op een hete plaat bij 37 °C. Nadat de muizen zijn ontwaakt, houdt u ze ongeveer 2 uur warm. Nadat u hebt bevestigd dat er geen abnormaal gedrag van de muizen is, brengt u de kooien terug naar het kweekrek.