受精卵显微注射用于在小鼠中产生基因盒敲入和絮状等位基因

根据筑波大学动物实验条例和教育部管辖的学术研究机构正确进行动物实验和相关活动的基本准则，所有动物实验均经筑波大学机构动物实验委员会批准进行， 日本的文化、体育、科学和技术。使用10-25周龄的两性C57BL / 6J小鼠作为受精卵供体。ICR小鼠（超过10周）用作受体小鼠。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。 1. 确认无细胞系统中crRNA切割活性 将 2 nmol的 crRNA（干）和 20 nmol的 tracrRNA（干）分别溶解在 25 μL 和 250 μL 无 RNase 的水中（参见 材料表）。注意：使用CRISPOR选择预测具有高切割活性且尽可能少脱靶的CRISPR靶序列（参见 材料表）。在基因盒敲入的情况下，将序列靶向插入位点。使用KOnezumi选择要絮凝的外显子（见 材料表）。 通过基因组PCR9扩增含有靶位点的DNA片段（约0.5-1 kb）。使用常见的PCR产物提取试剂盒纯化该PCR扩增子（参见 材料表）。 制备 10 μL CRISPR 混合物（在 Cas9 核酸酶反应缓冲液中制备 100 ng/μL crRNA、150 ng/μL tracrRNA 和 1 ng/μL Cas9，参见 材料表）。为了构建CRISPR-Cas9复合物，将CRISPR混合物置于37°C的加热块中30分钟。 将总体积（10μL）的CRISPR混合物加入步骤1.2中所述的PCR产物（10μL，20ng / μL）中，并在37°C下孵育1小时。加入 1 μL RNase （500 ng/μL） 以在 37 °C 下降解 crRNA 和 tracrRNA 30 分钟，因为在电泳过程中必须不存在 RNA。使用含有十二烷基硫酸钠（2% w / v）的上样染料对上述样品进行电泳。注意：在极少数情况下，观察到没有切割活性的crRNA。在这种情况下，建议重新设计基因组编辑设计。 2.用于受精卵显微注射的crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白和供体DNA混合物的制备 在无RNase的水中制备CRISPR溶液（50 ng/μL的crRNA，200 ng / μL的tracrRNA和200 ng / μL的Cas9）。制备供体 DNA 溶液（20 ng/μL 自构建质粒 DNA 载体）。通过孔径为0.22μm的无菌注射器过滤器过滤供体DNA溶液。混合等体积的CRISPR溶液和过滤的供体DNA溶液。确保每种的最终浓度为 25 ng/μL crRNA、100 ng/μL tracrRNA、100 ng/μL Cas9 和 10 ng/μL 供体 DNA。这种混合物在下文中将被称为RNPD。注意：当切割两个位点时，例如在絮凝小鼠生产过程中，每个crRNA的浓度必须为25ng / μL。供体DNA是环状质粒DNA，可以使用普通的小型制备离心柱试剂盒纯化（参见 材料表）。必须将制备的溶液放在冰上并尽快用于显微注射。 3.通过自然交配获得小鼠受精卵 显微注射前3天将5IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG，见 材料表）皮下注射到C57BL / 6J雌性小鼠（10-25周龄）中。大约46-48小时后，腹膜内施用5IU人绒毛膜促性腺激素（hCG，见 材料表）。将PMSG和hCG处理的雌性小鼠与雄性C57BL / 6J小鼠共同容纳，并在第二天早上检查阴道塞。注意：从一只雌性C57BL / 6J小鼠可以获得大约15-25个受精卵。时间线如图 1 所示。 准备两个用于受精卵培养的35 mm培养皿，如图 2所示。将它们放入培养箱（37°C，5%CO2）中直至使用。这些可以存放过夜。 通过颈椎脱位对确认阴道塞的雌性小鼠实施安乐死，并使用小剪刀从下腹部中线切开腹部皮肤和肌肉层到肋骨下方。注意：遵循当地动物伦理委员会关于安乐死的建议。 收集输卵管并将其置于培养皿盖上含有0.75mg / mL透明质酸酶的20μLM2培养基中（参见 材料表）。用细尖镊子拿起一个输卵管，并通过菌毛将约 50 μL 的 M2 培养基与透明质酸酶灌注。注意：此时，受精卵被许多积云细胞松散地包围。 30秒后，使用玻璃毛细管用少量培养基拾取形态正常的受精卵，并通过将它们转移到新鲜的M16中滴中来洗涤它们。将洗净的受精卵转移到培养皿（图2）中进行池化。注意：时间线如图 1 所示。形态正常的受精卵具有雄性和雌性原核以及两个极体，这些极体没有严重损害球形15。受精卵的形态因菌株和物种而异。 重复步骤3.3和3.4，直到检索到所有受精卵。大约 100 个受精卵可以汇集在培养皿中的一滴 M16 中。将培养皿储存在培养箱（37°C，5%CO2）中直至显微注射。 4.显微注射针的制备 使用可编程移液器拉拔器拉动一些玻璃移液器（参见 材料表）。注意：显微注射针必须具有细尖和长锥度。如果拉拔器具有用于制作用于卵胞浆内精子注射的针头的程序，则可以使用相同的程序来制作用于显微注射的针头。 通过撞击连接到微锻尖端的玻璃球来打破显微注射针的尖端。确保显微注射针的尖端尺寸直径约为1μm。在显微镜下以1000倍放大倍率检查尖端尺寸。 使用微锻件在距离尖端约2-3毫米处弯曲显微注射针。注意： 弯曲的角度取决于显微操纵器的设置。弯曲过多会降低压电脉冲的有效性。 5.受精卵显微注射 将1-1.5厘米的操作液（压电效应所需的惯性体作为汞的替代品，见 材料表）注入显微注射针的中心，并将其连接到带有压电陶瓷促动器的手动微量注射器支架上。此外，将保持针连接到对面的手动微量注射器支架上。将操作液以逐渐的压力移动到显微注射针尖。将两个手动显微注射器支架固定在显微操纵器上。注意：从显微注射针尖流出的操作液可以在显微镜下以50倍放大倍率观察。调整液体发射量后，当施加压电脉冲时可以观察到液体的飞溅，确认压电脉冲是有效的。如果无法确认，请重新准备显微注射针。 准备带有三个液滴的进样室：（1）10μL M2培养基;（2） 5 μL 12% 聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 在 M2 培养基中;（3） crRNA、tracrRNA、Cas9 蛋白和供体 DNA （RNPD） 溶液的 5 μL 混合物。以与步骤3.2相同的方式用矿物油覆盖液滴，并将注射室设置在倒置显微镜载物台上。在倒置显微镜下，以50倍放大倍率，将显微注射移液管降低到12%PVP液滴中。吸出并分配 12% PVP 以清洁显微注射针尖的内部并将其转移到 RNPD 液滴中。 将手动显微注射器置于负压下，将RNPD溶液吸入显微注射针中。等待几分钟，直到吸出足够的体积;在放大50倍的显微镜下，用液体填充显微注射针的整个内部。停止进气，通过将手动显微注射器设置为正压，逐渐排出RNPD溶液。将显微注射针的尖端移动到油中。注意：逆时针转动手动微量注射器的旋钮进行吸入。要停止吸入，顺时针旋转旋钮并在显微镜下观察时逐渐增加压力。RNPD溶液将逐渐排出。显微注射针中的液位运动可以确认流出。 将50个受精卵放入M2液滴中，并轻轻地将保持移液管降低到同一液滴中。将显微注射针转移到含有受精卵的M2液滴上。切换到20倍物镜，并聚焦在显微注射移液器的尖端。注意：放入尽可能多的受精卵，可以在10分钟内注射。 握住受精卵并通过移动显微操纵器专注于原核。将显微注射针插入受精卵，并将尖端靠近原核。一旦尖端到达原核膜，施加压电脉冲（强度：6-10，速度：1）刺穿。当显微注射针刺穿原核时，注射RNPD溶液，观察原核的肿胀。一旦原核完全充气，迅速拔出针头。对女性和男性原核执行相同的程序。注意：在显微镜下可以清楚地看到注射前核的膨胀。这种通货膨胀的程度很难用语言表达，但可以通过参考以前的报告15来确认。 将注射的受精卵移动到M2液滴内的另一个位置，以在注射前后识别受精卵。 重复步骤5.5-5.6，直到M2液滴中的所有受精卵都被注射。注射后，将受精卵转移到新鲜的M16培养皿中。 注射后10分钟选择存活的受精卵。去除被注射损坏的裂解受精卵，并将存活的受精卵分布到 M16 培养皿中的每个液滴中。每个液滴必须包含20-24个受精卵，供一名假怀孕女性使用。这减少了胚胎移植过程中M16培养皿暴露于培养箱外环境的时间。注意：在最佳注射条件下，存活率为90%-95%。这取决于针尖的大小、压电脉冲的强度以及RNPD溶液的流出压力。 6. 胚胎移植到输卵管中 为了获得假怀孕小鼠，在发情期将每只雌性ICR小鼠与血管化的雄性ICR小鼠交配。第二天检查插头。注意：从20对交配中获得大约15只假怀孕小鼠。 向假性妊娠雌性小鼠皮下施用三种类型的混合麻醉剂（0.2mg / kg美托咪定，4.0mg / kg咪达唑仑和2.5mg / kg布托酚，参见 材料表）。通过呼吸频率降低和尾部夹伤和后肢踏板撤回反射消失来确认适当的麻醉。按照当地动物伦理委员会的建议涂抹眼药膏润滑眼睛。 在剃刀剃须小鼠的背部区域处于俯卧位并对手术区域消毒三次后，在碘或氯己定磨砂膏和酒精之间交替，用小解剖剪刀沿脊柱切开背侧皮肤约1厘米。 将背侧切口伤口向腹侧一侧移动，切开可以看到卵巢的肌肉层，用镊子抓住卵巢上方的脂肪，然后取出卵巢、输卵管和子宫。用细化夹固定脂肪（见 材料表）。将生殖组织放在无菌纱布上，以避免直接接触外套。 按以下顺序，将少量培养基（M2或M16），一些气泡作为标记，并将受精卵放入移液管中进行转移。注意：每个输卵管转移大约 10-12 个受精卵。 使用微剪切（见 材料表）在壶腹和输卵管的螓毛之间做一个切口（刚好足够长以允许玻璃移液管进入），将受精卵引入切口，同时确认气泡已被引入。 以类似方式将植入到另一个输卵管中（步骤6.6）。 用自动夹缝合外皮（见 材料表）。注意：不要缝合切开的肌肉层，除非切口伤口不可避免地很大。切开的肌肉层的理想尺寸应小于2-3毫米。如果切口大于5毫米，应使用无菌缝合针和线缝合肌肉层（见 材料表）。 7. 动物恢复 皮下给予小鼠盐酸阿替美唑（0.3mg / kg）。注意：遵循当地动物伦理委员会关于术后镇痛的建议。 然后，将小鼠放在笼子中，并在37°C的热板上保温。 小鼠被唤醒后，保持它们温暖约2小时。确认小鼠没有异常行为后，将笼子放回繁殖架。