בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

איסוף הרקמות האנושיות אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת וושינגטון (מזהה מחקר: STUDY380 ו- CR ID: CR3603) ובוצע על ידי המעבדה לחקר מומים מולדים. המעבדה לחקר מומים מולדים נתמכה על ידי פרס NIH מספר 5R24HD000836 מהמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע”ש יוניס קנדי שרייבר. הדגימות נאספו מהמשתתפים שהסכימו לכך ונשלחו ללא זיהוי וללא כל מידע בריאותי. דגימות המעי הדק אוחסנו בתמיסת מלח מאוחסנת בפוספטים (DPBS) של דולבקו הקרה כקרח, ונשלחו במשך הלילה למעבדה המקבלת. 1. הכנת מגיב הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של ריאגנטים ומספרים קטלוגיים; הכרכים המומלצים הם לצלחת של 6 בארות, אלא אם כן צוין אחרת. יש להכין אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1% על-ידי המסת 50 מ”ג של אבקת BSA ב-50 מ”ל של תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS) עם 100 מיקרוגרם/מ”ל של אנטיביוטיקה פרימוצין רחבת טווח כדי לצפות את כל כלי הפלסטיק והקצוות שבאים במגע עם רקמות או אנטרואידים.כדי לצפות ב-BSA, הניחו קצוות פיפט לא מסוננים בצינור חרוטי של 50 מ”ל עם מספיק BSA כדי לכסות את הקצוות, הוסיפו 1-2 מ”ל של BSA כדי לכסות את משטח צלחת פטרי, או מלאו 15 מ”ל צינורות חרוטיים ב-BSA למשך 20-30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. הכן את מדיית ה-DPBS על-ידי ערבוב של 50 מ”ל של DPBS עם 100 מיקרוגרם/מ”ל פרימוצין ו-50 מיקרוגרם/מ”ל גנטמיצין. הכן מדיה זו עם ובלי 2.5 מיקרוגרם / מ”ל אמפוטריצין. הכן מדיית גידול אנטרואידית על ידי ערבוב 2 מ”ל של מדיום גידול אורגנואידים, 100 מיקרוגרם / מ”ל פרימוצין, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 2.5 מיקרומטר CHIR99021. הכינו מדיה טרייה מדי יום וחממו אותה באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.הערה: מקדם הדילול עבור Y27632 הוא 1:250. עבור CHIR99021, דלל את פתרון מלאי CHIR ל- 1:100 במדיה חמה ולאחר מכן ל- 1:40 במדיית צמיחה אנטרואידית כדי להשיג דילול של 1:4000. הכן את תערובת המטריצה של ממברנת המרתף על ידי הוספה למלאי של מטריצת ממברנת המרתף 10 μM Y27632 ו- 2.5 μM CHIR99021. הכינו סך של 285 מיקרו-ליטר מתערובת מטריצת קרום המרתף הסופית בריכוז חלבון של 8 מ”ג/מ”ל עבור באר אחת של צלחת בת 6 בארות.הערה: מטריצת קרום המרתף צריכה להיות קרה כקרח כדי להישאר בצורה נוזלית ותתמצק בטמפרטורות חמות יותר. ריכוז החלבון של מטריצת קרום מרתף המניות קובע את הנפח הנדרש ליצירת ריכוז חלבון סופי של 8 מ”ג/מ”ל באמצעות המשוואה:כרך 1 × ריכוז 1 = כרך 2 × ריכוז 2 יש להכין 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול 32% PFA ב-PBS ב-1:8, ולאחסן בטמפרטורת החדר. הפוך 0.5 מ”ל עבור כל באר של enteroids להיות קבוע. הכן מאגר חסימה על ידי הוספת 5% סרום עיזים ו-0.5% טריטון X-100 ב-PBS. הכינו 1 מ”ל לנוגדן הראשון לכל באר ו-0.5 מ”ל לנוגדן הנוסף לכל באר.הערה: יש להשתמש בסרום מאותו המין שבו נמצא המארח של הנוגדנים המשניים הכינו נוגדנים ראשוניים ומשניים, מדוללים בחסימת חיץ בריכוז המומלץ על ידי היצרן לכל נוגדן. יש להכין 5 מיקרוגרם/מ”ל דמידינו-2-פנילינדול (DAPI) על-ידי דילול ל-1:200 מתמיסת מלאי של 1 מ”ג/מ”ל ב-PBS. לעשות 0.5 מ”ל לכל באר של אנטרואידים מוכתמים. הכינו 70% גליצרול ב-PBS והכינו 0.5 מ”ל להרכבת האנטרואידים על שקופיות מיקרוסקופ. הכן 5 מ”ג/מ”ל דקסטרון-FITC (פלואורסצאין-איזותיוציאנט) על ידי דילול תמיסת המלאי של 25 מ”ג/מ”ל ב-PBS ביחס של 1:5. הכינו 20 מיקרו-ליטר למיקרו-הזרקה. הכינו ליפופוליסכרידים (LPS) ודקסטרון-FITC על ידי שחזור אבקת ה-LPS ב-PBS לתמיסת מלאי של 5 מ”ג/מ”ל. יש לדלל את תמיסות המלאי של LPS ו-dextran ב-PBS ל-0.1 מ”ג/מ”ל ול-LPS של 0.5 מ”ג/מ”ל ול-5 מ”ג/מ”ל דקסטרן-FITC. הכינו 20 מיקרו-ליטר למיקרו-הזרקה. הכן אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N,N,N’,N’-חומצה טטראצטית (EGTA) על ידי יצירת תמיסת מלאי של 0.2 M על ידי המסת אבקת EGTA במים מזוקקים והתאמת ה-pH לכ-8 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl). הכן ריכוז בדיקה של 2 mM במדיה תרבותית על ידי ביצוע דילול 1:100. 2. אוסף דגימות לאחר קבלת הדגימות, יש לבצע בידוד וציפוי של תאי אפיתל בטווח של 24 שעות מאיסוף הדגימות. 3. ציפוי תאי אפיתל מעיים במטריצת קרום מרתף מדגימות שלמות הערה: הליך זה תואם לפרוטוקולים ששונו מהמעבדה למידול רקמות תרגומיות באוניברסיטת מישיגן12,13,14. שימוש במדיית צמיחה עם מקדם Wnt גבוה מניב תוצאות עקביות עבור הקמה אנטרואידית. לאחר התבססות האנטרואידים, השתמש באותה מדיה עם גורם Wnt גבוה כדי להניע את האנטרואידים לצורות כדוריות עבור מיקרו הזרקה. מעבירים את מקטעי המעי לצלחת פטרי בגודל 60 מ”מ על 15 מ”מ עם DPBS קרים כקרח עם אמפוטריצין ומשרים במשך 20 דקות על קרח. בזמן שהרקמה נספגת, זהה את האזורים (תריסריון, ג’ג’ונום או איליאום) של המעי הדק והסר את רקמת החיבור וכלי הדם באמצעות מלקחיים ומספריים. יש לשטוף את תכולת הלומן לפי הצורך באמצעות מחט קטנה של 23-25 גרם ומזרק 3 מ”ל מבלי לשבש את האפיתל. חותכים את מקטעי המעי לחתיכות 3-5 מ”מ באמצעות אזמל ומניחים 1-2 חתיכות (לציפוי בבאר אחת של צלחת 6 בארות) בצלחת פטרי בגודל 35 מ”מ x 15 מ”מ המכילה 0.5-1 מ”ל של מדיום גידול אורגנואידים על קרח. באמצעות ניתוח מיקרו מספריים ומלקחיים, לחתוך את צינור המעי לאורך. השתמש בקצה המלקחיים כדי לגרד את תאי האפיתל מהחיתולית תחת מיקרוסקופ סטריאו 10x. הסר את החיתולית ומערבב את המנה כדי לשבור את גושי התאים. השתמש בקצה חיתוך פיפטה של 20 μL כדי להעביר את התאים והמדיה במרווחים של 5-10 μL לתערובת מטריצת קרום המרתף כדי ליצור תמיסה של 285 μL בריכוז חלבון מטריצה של 8 מ”ג/מ”ל. צניחה למעלה ולמטה באיטיות של פי 20 כדי לערבב תאים במטריצת קרום המרתף על קרח באמצעות קצה חיתוך של 200 μL. מניחים חמש רצועות של 50 μL של תערובת מטריצת קרום מרתף התא בבאר אחת של צלחת 6 מחוממת מראש שנשמרה על לבנה קצף חמה. דגירה של הצלחת באינקובטור תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר ולהתקשות. הוסף 2 מ”ל של מדיית הצמיחה האנטרואידית לתוך הבאר של רצועות מטריצת קרום המרתף המתמצקת והניח בחזרה בתוך אינקובטור תרבית התא. שנה את המדיה מדי יום כדי להגביר את הצמיחה האנטרואידית. בדוק אם יש התמיינות של תאי גזע מעיים תחת מיקרוסקופ הפוך פי 10 מדי יום. לאחר 10-14 ימים, להעביר את האנטרוידים לתוך באר אחת של צלחת 12-well או 6-well, בהתאם צפיפות enteroid. התחל לשנות את המדיה כל יומיים ולעבור ביחס של 1:2 כל 5-7 ימים כאשר האנטרוידים מתחילים לשגשג.הסר את התאים שאינם מתמיינים לאנטרוידים עם שכבת המטריצה של קרום המרתף במהלך המעברים. צור מלאי קפוא של אנטרוידים עם מעבר נמוך על ידי הקפאתם ב-80% מדיית גדילה, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), במידת הצורך. 4. צביעה אימונופלואורסצנטית של אנטרואידים הערה: תהליך התיקון וההכתמה אורך 3 ימים. בפרוטוקול זה תיקנו והוכתמנו גרעינים (DAPI), סמני אפיתל (villin, CDX2), ליזוזימה, מוצין וחלבוני צומת הדוקים (claudin 2, claudin 3, occludin, zonula occluden-1) באמצעות פרוטוקול שונה15. תמונות פלואורסצנטיות צולמו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. תיקוןהערה: תהליך זה נעשה בדרך כלל במקביל למעבר האנטרואיד או להליך ההקפאה.מניחים את צלחת האנטרואיד על קרח. הסר את מדיית הצמיחה ושטוף בעדינות 2x עם DPBS קר. זהה את האנטרוידים שיש לתקן ולהכתים. העבירו אותם לצלחת של 12 בארות על ידי ניקודם בזהירות עם קצה חתך של 200 μL או באמצעות לולאת חיסון של 1 μL. מניחים אנטרואידים בבארות נפרדות אם יש לבצע צביעה בנוגדנים שונים. הסר כמה שיותר נוזלים עם קצה של 200 μL מבלי להפריע לאנטרואידים. מוסיפים 0.5 מ”ל של 4% PFA ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו את הצלחת מדי פעם כדי להקל על ניתוק האנטרוידים ממטריצת קרום המרתף. בחן באופן גס כדי לקבוע את הניתוק של האנטרואידים ממטריצת קרום המרתף. שאפו בזהירות והשליכו את ה- PFA הנוזלי מבלי לשבש את האנטרואידים. יש לשטוף עם PBS 3x כדי להסיר PFA וכל מטריצת קרום מרתף שיוריתהערה: שאיפת הנוזל תחת מיקרוסקופ סטריאו יכולה לעזור להימנע מאנטרואידים. אנטרואידים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 °C (64 °F) עד 1 חודש. חסימתהסר בזהירות PBS שיורי עם פיפטה 200 μL, מבלי להפריע את enteroids. הוסיפו 0.5 מ”ל של חיץ חוסם ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הסר והשלך את המאגר החוסם עם פיפטה 200 μL, נזהר כדי למנוע הפרעה אנטרואידים. צביעת נוגדניםהוסף 500 μL של נוגדן ראשוני בחסימת חיץ לכל באר עם אנטרואידים. עבור נוגדנים ראשוניים ועבור ליזוזים, מקדם הדילול הוא 1:100, עבור CDX2 מקדם הדילול הוא 1:100, ועבור villin גורם הדילול הוא 1:50. לדגור ב 4 °C (84 °F) לילה. ביום שלמחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף 3x עם PBS. אפשר 10-15 דקות של זמן דגירה לכל שטיפה. חזור על שלבים 4.3.1.-4.3.2. עבור הנוגדן המשני עם מקדם דילול של 1:400. יש להוסיף 500 μL של DAPI ב-5 מיקרוגרם/מ”ל ב-PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, יש לשטוף 3x עם PBS, ולאפשר זמן דגירה של 10-15 דקות לכל כביסה הרכבההסר כמה שיותר PBS. לשטוף את האנטרואידים המוכתמים עם 70% גליצרול 1x. הרם את האנטרואידים מהצלחת באמצעות לולאת חיסון של 1 μL או קצה חתך של 200 μL והרכב עם 70% גליצרול על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. כדי לשמר את המבנה התלת-ממדי של האנטרואידים, הקפידו על רווח של 0.5-1 מ”מ בין מגלשת הזכוכית התחתונה לבין הכיסוי. השתמש בחתכים של יריעת גומי סיליקון דקה או כיסוי זכוכית כדי ליצור רווח בין מגלשת הזכוכית למכסה הזכוכית. כעת ניתן לדמות את האנטרוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. 5. הכנה למיקרו הזרקה של אנטרואידים הערה: פרוטוקול המיקרו-הזרקה הוא פרוטוקול שונה מ- Hill et al.16 כדי להתאים למשאבים ולהגדרה. חלק משלבי ההכנה צריכים להסתיים כמה ימים מראש. הגדרת הגדרת המיקרו-הזרקותהגדר את מנגנון המיקרו-אינז’קטור בתוך ארון ביו-בטיחות או על דלפק נקי, בהתאם למטרת הניסויים, כדלקמן: מיקרוסקופ סטריאו לצפייה, מיקרומניפולטור עם nobs בקרה על ציר X, Y ו- Z המותקן על מעמד כבד ליד המיקרוסקופ, מחזיק מיקרופיפטה המותקן על זרוע המיקרומניפולטור, צינור מיקרו-אינז’קטור המחבר את מחזיק המיקרופיפטה ומזרק עם פקק תלת-כיווני, ולאחר מכן למשאבה פנאומטית ולמקור אוויר בקיר המחובר למשאבה (איור 1). יש לחטא את מנגנון המיקרו-הזרקה ב-70% אתנול לפני השימוש הניסיוני ולאחריו. בדוק את מיקום המיקרוסקופ והמיקרומניפולטור כך שיתאימו למפרט הפיזיקלי הרצוי, כולל הזזת ידיות הציר כדי להבטיח שהמיקרופיפטה יכולה להגיע לדגימה הממוקדת. הכנת המיקרופיפטההערה: בצע שלבים אלה מראש.השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך את צינורות נימי הזכוכית לתוך המיקרופיפטים. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, הניחו את המיקרופיפטה על מחזיק מיקרופיפטה אופקי (איור 2), התמקדו בקצוות וחתכו את הקצוות באמצעות זוג מספריים זעירים תוך כדי התבוננות דרך עיניות המיקרוסקופ. הכינו כ-10-15 מיקרו-פיפטות בגודל קצה דומה לכל ניסוי. בדוק את גודל הקצה על ידי משיכת 0.5-1 μL של נוזל וספור כמה משאבות דרושות כדי לרוקן את הנפח. בדוק כמה גדלי טיפים כדי למצוא את הגודל המתאים לניסוי. גודל קצה מתאים פולט כ-10-30 nL נפח לכל משאבה. אחסנו את המיקרופיפטים מזכוכית חתוכה בקופסה או בצינור נקיים מבלי לפגוע בקצוות.הערה: מיקרו-פיפטות חתוכות מראש זמינות באופן מסחרי. הכנה אנטרואידיתמניחים צלחת של אנטרואידים גדולים וכדוריים בעיקר על קרח. החלף את מדיום הצמיחה הישן במדיום טרי. נתקו בעדינות את נקודות המטריצה של קרום המרתף מהצלחת בעזרת מרים תאים. סובבו את נקודות הג’ל מצד לצד על הקרח כדי לשבור את מטריצת קרום המרתף מבלי להפריע לאנטרואידים. בחרו כ-10-15 אנטרוידים כדוריים עם קצה פיפטה חתוך של 20 μL מתחת למיקרוסקופ סטריאו והוסיפו למטריצת קרום המרתף כדי ליצור 285 μL של תערובת ריכוז חלבון של 8 מ”ג/מ”ל. פיפט מעלה ומטה בעדינות עם קצה חתוך של 200 μL כדי לערבב את האנטרואידים מבלי לשבור אותם. צלחת חמש נקודות ג’ל 50 μL במרכז צלחת עגולה של 35 מ”מ x 10 מ”מ תרבית תאים פטרי או אחת עם ממדים דומים. דגירה של נקודות ג’ל אנטרואיד ב-37°C למשך 10 דקות כדי להתמצק. לאחר מכן, להוסיף 1 מ”ל של מדיום צמיחה טרי למנה. לדגור את האנטרואידים לפחות 2-3 ימים לייצוב ועד האנטרואידים להגיע לגודל מתאים של 0.5-1 μL.הערה: חשוב שתהיה מנה עם דופן נמוכה לגישה קלה יותר לאנטרואידים וקוטר קטן לנפח קטן של מדיום הצמיחה. מיקרו-הזרקה של דקסטרן-FITC וחומר נבדקכבו את הפקק התלת-כיווני אל המשאבה הפנאומטית. למלא את micropipette עם החומר מוזרק, במקרה זה dextran-FITC עם או בלי LPS. הכינו צלחת פטרי מכוסה ברצועת סרט שקוף. מניחים שתיים עד ארבע נקודות 1 μL של חומר מוזרק על הסרט. השתמש במיקרומניפולטור כדי להניע את קצה המיקרופיפטה רק לתוך הנוזל אך מעל הסרט תחת הדמיה של מיקרוסקופ סטריאו. משוך בעדינות את המזרק כדי למשוך את החומר המוזרק לתוך micropipette. ממלאים את המיקרופיפטה ב-2-4 מיקרון ליטר של חומר מוזרק ודוחפים על המזרק כדי להסיר אוויר בקצה המיקרופיפט. בדוק את עמודת החומר המוזרק במיקרופיפטה כדי לוודא שאין כיס אוויר. רשום את נפח החומר המוזרק שנסוג בתוך המיקרופיפטה.הערה: הנוזל נראה בצבע ירקרק עקב dextran-FITC. הפעל את מקור האוויר המחובר למשאבה הפנאומטית, המספקת לחץ אוויר של כ -60 psi. הפעל את המשאבה והגדר את משך המשאבה ל-10-15 אלפיות השנייה. סובבו את הפקק על המזרק כדי לפתוח את הקו מהמשאבה למיקרופיפטה.הערה: משך המשאבה הארוך יותר מאפשר לשחרר יותר חומר לכל משאבה. מומלץ להשתמש באותו משך משאבה ומיקרופיפטים עם גדלי קצה דומים לכל הניסוי לצורך הערכת נפח ההזרקה. הסר את האנטרואידים מאינקובטור תרביות התאים והנח את הכלים על גבי לבנה קצף חמה במיכל מכוסה כדי להגביל את החשיפה לאור לאחר מיקרו הזרקה. הניחו את צלחת הפטרי עם האנטרואידים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והזיזו את ידיות המיקרומניפולטור כדי למקם את קצה המיקרופיפטה בזווית של כ-35°-45° למשטח האופקי (איור 3). זה דורש קצת תרגול מראש. דמיינו ומפה את האנטרואידים בכל צלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ כדי להכין תוכנית להזרקת כ-3-5 אנטרוידים כדוריים לכל מנה. ברגע שקצה המיקרופיפטה קרוב למשטח הנוזל, הביטו לתוך עיניות המיקרוסקופ כדי לקדם את הקצה לעבר האנטרואיד הממוקד. נקבו את האנטרואיד עם קצה המיקרופיפטה על ידי קידום ידית ציר ה-z באמצעות תנועה איטית ומדויקת. הקיר האנטרואידי ידכא ויקפוץ בחזרה ברגע שהקצה יעבור דרך המשטח האנטרואידי, ואז ההתקדמות צריכה להיפסק. הקש על דוושת המשאבה ברגל אחת ומלא את האנטרואיד בתמיסת dextran-FITC הירקרק עד שהוא מורחב מעט. רשום את מספר המשאבות כדי לחשב את נפח השאיבה ואת ריכוז הדקסטרון. למשוך את קצה micropipette לאחר סיום microinjection ולעבור אנטרואיד הבא. עם תרגול, התהליך יכול לעבור בצורה חלקה.אם הקצה נשבר, החלף אותו במיקרופיפטה אחרת בגודל קצה דומה. משכו נפח מספיק של חומר מוזרק עבור כל האנטרוידים באותה קבוצת חשיפה ושנו את המיקרופיפטה בין חומרים מוזרקים כדי למנוע זיהום צולב. הניחו את צלחת האנטרואיד המוזרקת מתחת לכיסוי כדי למנוע חשיפה לאור. איסוף ומדידה של דקסטרן-FITCלאחר הליך המיקרו הזרקה, הסר מיד את מדיה התרבית. יש לשטוף עם מדיית צמיחה טרייה פי 2 כדי להסיר שאריות של dextran-FITC. הוסף מדיה טרייה ורשום את הזמן כזמן 0 לאחר מיקרו הזרקה.הערה: ייתכן שתזדקק לאדם שני כדי לבצע שלב זה מבלי לשבש את תהליך המיקרו-הזרקה. אסוף 200 μL של מדיית תרבית בצינור מיקרופוגה אטום של 0.5 מ”ל ולאחר מכן החלף את מדיית התרבות שהוסרה באותו נפח של מדיית צמיחה טרייה ב-1 שעות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 8 שעות, 10 שעות ו-12 שעות לאחר מיקרו-הזרקות.הערה: מרווח הזמן עשוי להשתנות בהתאם לניסוי. בחשיפה בזולטרלית, המדיה החלופית צריכה להכיל את החשיפה באותו ריכוז. אחסן את מדיית התרבית שנאספה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדוד את ריכוז הדקסטרן תוך 24 שעות. אחסן שאריות מדיה ב- −80 °C לניתוחים אחרים. בסוף אוסף המדיה של התרבית, קצרו את האנטרוידים להפקת RNA או הדמיה, במידת הצורך. מדוד ריכוזי דקסטרן-FITC באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. בנה עקומה סטנדרטית עבור כל לוח באמצעות דילולים סדרתיים ועל ידי התאמת קו רגרסיה ליניארי כפי שמוצג באיור 4. תקן את הספיגה עבור הנפח שהוסר של מדיה תרבותית המכילה dextran שהוחלף במדיית צמיחה טרייה ללא דקסטרן כדלקמן: הסרה של 200 μL מתוך 2 מ”ל של מדיה תרבותית היא 10% לפי נפח.ספיגה מתוקנת ב-2 שעות = (ספיגה ב-1 שעות x 10%) + ספיגה מדודה בשעתייםספיגה של המדיום המתוקן הראשון אינה זקוקה לתיקון. לאחר מכן, חשב את ריכוז הדקסטרן מערך הספיגה המתוקן באמצעות משוואת העקומה הסטנדרטית. לצורך הנורמליזציה, חלקו את ריכוז הדקסטרן במספר הכולל של המשאבות עבור כל צלחת פטרי ולאחר מכן הכפל במספר הכולל הגדול ביותר של משאבות לכל מנה.הערה: כל החשיפות מבוצעות במשולשים (שלוש צלחות פטרי לכל חשיפה עם 3-5 אנטרואידים מיקרו-מוזרקים למנה). הערכים הממוצעים של המשולשים מושווים בין חשיפות באמצעות מבחן t של סטודנט.