اختبار النفاذية الظهارية في الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين
Summary
يفصل هذا البروتوكول إنشاء المعوية ، وهي نموذج معوي ثلاثي الأبعاد ، من الأنسجة المعوية الجنينية. تم استخدام التصوير المناعي الفلورسنت للمؤشرات الحيوية الظهارية لتوصيف النموذج. التعرض القمي لعديدات السكاريد الشحمية، وهو سم داخلي بكتيري، باستخدام تقنية الحقن المجهري يحفز النفاذية الظهارية بطريقة تعتمد على الجرعة تقاس بتسرب الدكستران الفلوري.
Abstract
تظهر الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين البشري كنموذج واعد في المختبر لدراسة الإصابات المعوية عند الأطفال الخدج. تظهر الأمعاء قطبية ، تتكون من تجويف ذو حدود قمية ، وتقاطعات ضيقة ، وطبقة خارجية بازوجانبية معرضة لوسائط النمو. تشمل عواقب الإصابات المعوية التهاب الغشاء المخاطي وزيادة النفاذية. غالبا ما يكون اختبار نفاذية الأمعاء في الأشخاص الخدج الضعفاء غير ممكن. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج معوي مشتق من أنسجة الجنين في المختبر لدراسة الإصابات المعوية عند الأطفال الخدج. يمكن استخدام المعوية لاختبار التغيرات في النفاذية الظهارية التي تنظمها بروتينات الوصلة الضيقة. في الأمعاء ، تتمايز الخلايا الجذعية المعوية إلى جميع أنواع الخلايا الظهارية وتشكل بنية ثلاثية الأبعاد على مصفوفة غشاء سفلي تفرزها خلايا ساركوما الفئران. في هذه المقالة ، نصف الطرق المستخدمة لإنشاء الأمعاء من الأنسجة المعوية الجنينية ، وتوصيف بروتينات الوصلة الضيقة المعوية مع التصوير المناعي الفلوري ، واختبار النفاذية الظهارية. نظرا لأن dysbiosis البكتيري المهيمن سالب الجرام هو عامل خطر معروف للإصابة المعوية ، فقد استخدمنا عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، وهو سم داخلي تنتجه البكتيريا سالبة الجرام ، للحث على النفاذية في الأمعاء. تم حقن الدكستران المسمى بالفلوريسين في تجويف الأمعاء ، وتم قياس تركيزات الدكستران التسلسلية التي تسربت إلى وسائط الثقافة لتحديد التغيرات في نفاذية الخلايا شبه الخلوية. أظهرت التجربة أن التعرض القمي ل LPS يحفز النفاذية الظهارية بطريقة تعتمد على التركيز. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن dysbiosis السائد سالب الجرام يساهم في آلية الإصابة المعوية عند الأطفال الخدج.
Introduction
يتعرض الأطفال الخدج لالتهاب متكرر وطويل الأمد يعرضهم لخطر متزايد للإصابة المعوية مما يؤدي إلى إعاقة طويلة الأجل أو الوفاة1. وتواجه البحوث في هذا المجال تحديا يتمثل في محدودية القدرة على إجراء تجارب على الأطفال الخدج الضعفاء. علاوة على ذلك ، أعاق عدم وجود نماذج مناسبة الدراسة الشاملة للبيئة المعوية المبكرة2. فشلت النماذج الموجودة في المختبر وفي الجسم الحي في تمثيل البيئة المعوية البشرية المبكرة بشكل شامل. على وجه التحديد ، قد لا تشكل خطوط الخلايا الجنينية الظهارية المفردة تقاطعات ضيقة ، وتظهر النماذج الحيوانية استجابات التهابية ومناعية مختلفة عن الأطفال الخدج البشريين. مع اكتشاف إشارات Wnt كمسار أساسي في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية للسرداب المعوي والخلايا الجذعية للأنسجة Lgr5 + الجديدة ، تم إنشاء المواد العضوية المشتقة من الأنسجة المعوية مثل الأمعاء والقولون كما هو الحال في النماذج المختبرية 3،4،5. باستخدام هذه التكنولوجيا ، من الممكن إنشاء واستخدام نماذج معوية ثلاثية الأبعاد (3D) يتم تطويرها من أنسجة كاملة أو خزعة من الأمعاء لدراسة الاستجابات الظهارية للبيئة المعوية 6,7.
على النقيض من خطوط الخلايا المعوية النموذجية التي تنمو في الثقافة ، تظهر الأمعاء قطبية مع تجويف متصل ببروتينات تقاطع ضيقة8. هذا يسمح بالتعرض للحدود القاعدية في وسائط النمو ، وكذلك الحقن المجهري اللمعاني لتقييم الحدود القمي. علاوة على ذلك ، تظهر الأمعاء خصائص وراثية وفسيولوجية ومناعية مماثلة للظهارة البشرية 9,10. تسمح الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين بفحص دور الخداج في الوظيفة الظهارية. يمكن أن تشبه الخصائص الفريدة للمعوية البيئة المعوية المبكرة بشكل أوثق9. يمكن استخدام الأمعاء المشتقة من الأنسجة لاختبار سلامة التقاطع الضيق كشكل أحادي الطبقة أو كهياكل 3D مضمنة في خليط بروتين غشاء سفلي صلب. مطلوب تقنية الحقن المجهري للشكل الأخير إذا كان التعرض القمي مطلوبا. يتضمن قياس الاستجابات الظهارية في النماذج المعوية التعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو المؤشرات الحيوية عن طريق المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) ، أو تقنيات التصوير المتقدمة. توفر التقنية المعروضة هنا خيارا آخر ممكنا لقياس النفاذية الإجمالية باستخدام قياس الفلورومتر.
الإصابة المعوية عند الأطفال الخدج لديها إمراض متعدد العوامل يتضمن اختلال توازن المجتمع الميكروبي في الأمعاء. يمكن أن توفر المعوية نماذج ممتازة لدراسة جوانب معينة من الأمراض المعوية المبكرة مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر الذي ينطوي على وظائف ظهارية11. تظهر الأمعاء خصائص مماثلة لأمعاء الجنين البشري10. تعريض المعوية لعديد السكاريد الشحمي (LPS) ، وهو سم داخلي تنتجه البكتيريا سالبة الجرام ، في وسائط الثقافة كتعرض بازولي يحفز التعبير الجيني الذي يمكن أن يؤدي إلى زيادة الالتهاب والنفاذية المعوية7. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم التغيرات في النفاذية الظهارية الإجمالية بعد التعرض القمي للمنتجات البكتيرية مثل LPS. قد توفر النتائج نظرة ثاقبة على التفاعلات الميكروبية الظهارية المشاركة في التسبب في الإصابة المعوية. تتطلب الطريقة المصممة لاختبار النفاذية الإجمالية إعداد الحقن المجهري ومهارته.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل هذا البروتوكول إنشاء الأمعاء من الأنسجة المعوية الجنينية ، بالإضافة إلى توصيف النموذج مع تلطيخ الفلورسنت المناعي واختبار النفاذية الظهارية. تم اختبار نفاذية الأمعاء باستخدام تقنية الحقن المجهري وقياسات الدورة الزمنية التسلسلية لتركيز dextran-FITC المتسرب في وسائط الثقافة. حداثة هذا البروتوكول هي التعرض القمي الذي يشبه إلى حد كبير فسيولوجيا الأمعاء البشرية مقارنة بالتعرض القاعدي الجانبي في وسائل الإعلام الثقافية7. في الدراسات السابقة ، استخدم هيل وآخرون التصوير التسلسلي وحساب شدة التألق بمرور الوقت16. قام آريس وآخرون بتعريض الغشاء القاعدي الجانبي لنموذج ظهاري إلى LPS ثم قارنوا نمط التعبير الجيني الخلوي7. وبالمقارنة، نستخدم التعرض القمي للكواشف المختبرة ثم ندرس التغيرات المحتملة في النفاذية الإجمالية عن طريق قياس التركيزات التسلسلية للديكستران المتسرب في وسائط الثقافة. تسمح طريقتنا أيضا بإجراء تحليل مقارن تسلسلي للسيتوكينات التي تنتجها الخلايا الظهارية في وسائط الثقافة والتعبير الجيني عن طريق جمع الحمض النووي الريبوزي المرسال الخلوي. يستخدم LPS بشكل شائع لدراسة الإصابات المعوية في النماذج الحيوانية والمختبرية بسبب قدرته على تحفيز النفاذية والالتهابات 7,17. عندما تم اختبار LPS في هذا النموذج ، تم تمييز النفاذية الظهارية من خلال تركيز التعرض. يمكن توسيع هذا البروتوكول لدراسة أمراض الأمراض الأخرى باستخدام مواد مختلفة عن طريق الحقن الدقيق وقياسات النتائج.
تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول إنشاء الأمعاء من أنسجة الأمعاء الجنينية ، وتوصيف الأمعاء ، وتقنية الحقن المجهري. تعتمد سلامة هذه الدراسة على أخذ عينات دقيقة من الخلايا. استخدام المعالم التشريحية والأوعية الدموية مفيد لضمان اختيار الخلايا المعوية الصغيرة. نظرا للنمو القوي والتمايز بين الخلايا الجذعية المعوية الجنينية ، ليس من الضروري إجراء مكثف لعزل الخلايا الجذعية عن الخلايا الظهارية الأخرى. بعد إنشاء المعوية ، من المهم تأكيد خصائص النموذج عن طريق تلطيخ البروتينات وعلامات الخلايا. في هذا البروتوكول ، تم تلطيخ الأمعاء للخلايا المعوية باستخدام الفيلين و CDX2 ، وخلايا Paneth باستخدام الليزوزيم ، وخلايا الكأس باستخدام mucin، وجميع الخلايا الموجودة داخل ظهارة الأمعاء الدقيقة18،19،20. على النقيض من خطوط الخلية الواحدة التقليدية التي تعرض نوعا واحدا من الخلايا ، تحدد المعوية جميع أنواع الخلايا من الخلايا الجذعية السلفية المعوية8. يمكن تعديل جزء التلطيخ من هذا البروتوكول للعلامات الخلوية المحددة ذات الاهتمام. من الأمور الحاسمة لموثوقية هذا البروتوكول تقنية الحقن المجهري. يمكن التحقق من اتساق أطراف الماصة الدقيقة عن طريق قياس الحجم لكل مضخة باستخدام محلول dextran-FITC وتصور قطر الأطراف تحت المجهر. نظرا لخطر التلوث ، لا يمكن استخدام نفس الماصة الدقيقة لأكثر من تعرض واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يتأثر شكل ونمو الأمعاء بمحتويات وسائط نموها. وجدنا أن المعوية الكروية بدلا من القرنبيط على شكل قرنبيط قدمت نماذج أفضل للحقن المجهري. قد يكون الشكل الكروي ناتجا عن عامل Wnt أكبر في الوسائط21.
يعتمد هذا البروتوكول إلى حد كبير على مهارة المؤدي في الحقن المجهري لتقليل الاختلافات ، خاصة في القياسات الحساسة للوقت. يمكن تقليل الاختلافات من خلال وجود نفس الأداء المتمرس مع تقنيات متسقة ، واستخدام نفس أصل الخلية لتجنب التباين الجيني ، والاختبار في نفس الممر لإزالة تحيز النضج ، وتنمية الخلايا في نفس النوع من الوسائط لتمايز الخلايا المماثلة. قد تحفز مكونات وسائط النمو تمايزا متفاوتا للخلايا الجذعية في المختبر بدلا من بيئة الجسم الحي . على سبيل المثال ، في الجسم الحي ، لا يتم التعبير عن الليزوزيم حتى الأسابيع 22-24 من تطور الحمل عندما تتشكل خلايا Paneth وتصبح وظيفية22. ومع ذلك ، تمكنا من اكتشاف الليزوزيم في أمعائنا المعوية التي تم إنشاؤها من أمعاء الجنين لمدة 10 أسابيع. يمكن لهذه الطريقة أن تحد من عدد التعرضات التي تم اختبارها في وقت واحد بسبب المهارة التقنية العالية المطلوبة للحقن المجهري. يمكن أن يؤثر تسرب الدكستران من ثقب ثقب الحقن المجهري على تقييم النفاذية. للقضاء على هذا التأثير ، يوصى بالغسل الثلاثي مباشرة بعد الحقن المجهري لإزالة الدكستران المتبقي من الإجراء. يجب قياس تركيز الدكستران في الوسائط كل ساعة لمدة 4-6 ساعات بعد الحقن المجهري. يجب استبعاد التجارب التي تحتوي على ارتفاع كبير في تركيز الدكستران في غضون 2-4 ساعات بعد الحقن من التحليل النهائي.
هذه الطريقة لها العديد من المزايا. يتطلب تكلفة أقل وموارد أقل مقارنة بالطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء على transwell. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيعه إلى التعرض الآخر مثل البكتيريا الحية أو الفيروسات لدراسة التفاعل الأولي بين ميكروبات الأمعاء والظهارة. يمكن أن يحافظ التجويف المغلق للمعوية على نمو مستقر للبكتيريا الحية المحقونة بالميكرو دون تلوث وسائط النمو13. على عكس الطبقة الأحادية التي تتعرض لوسائط النمو وأكسجين الحضانة ، فإن التجويف المغلق هو مساحة ضيقة ومعزولة. لا يسمح التجويف المغلق بأي اتصال بوسائط النمو ومحتوى أكسجين مضيء أقل بمرور الوقت مع نمو البكتيريا الحية13.
استخدام الأنسجة المعوية الجنينية يصور بدقة أكبر الظهارة المعوية للأطفال الخدج بالمقارنة مع الخلايا الجذعية المعوية البالغة أو النماذج الحيوانية7. علاوة على ذلك ، فإن قطبية الأمعاء تسمح بكل من التعرض القمي والقاعدي والقياسات23. تشكل الأمعاء تجويفا مغلقا بتركيز أكسجين أقل ، والذي يحاكي بشكل أوثق تركيز الأوكسجين في الأمعاء24. وعلى النقيض من البروتوكولات16 الأكثر تقدما من الناحية التكنولوجية، فإن استخدام قياسات الوسائط الإجمالية يسمح بزيادة إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. أظهرت التجربة أن التسرب الظهاري يمكن أن يحدث عن طريق التعرض القمي ل LPS ويعتمد على التركيز. نظرا لأن هذه الطريقة تفحص التغيرات في تركيز الدكستران المتسرب ، فمن المفيد اكتشاف التغيرات الوظيفية الإجمالية في التقاطعات الضيقة. يمكن أن يكمل جمع الحمض النووي الريبي الرسول وتسلسل الأمعاء المكشوفة وتحليل اللطخة الغربية تحليل التغيرات الوظيفية الإجمالية. يدرس هذا النموذج سلامة الظهارة المعوية في نظام يشبه إلى حد كبير البيئة المبكرة ، وبالتالي ، يمكن استخدامه للحصول على فهم أفضل للإصابات المعوية المبكرة وغيرها من أمراض الأمراض.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور إيان غلاس والعاملين في مختبر أبحاث العيوب الخلقية في جامعة واشنطن على مشاركة أنسجة الجنين. كما نشكر الدكتور مايكل دام والدكتور جيسون سبنس في مختبر نمذجة الأنسجة الانتقالية في جامعة ميشيغان على دعمهما وتوجيههما الذي لا نهاية لهما طوال العملية.
Materials
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
Riferimenti
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
