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Neuroscienze

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Published: July 06, 2022
doi:
10.3791/64104
, , ,
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo

Summary

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

Abstract

La microglía, las únicas células inmunes residentes en el cerebro, participan activamente en el mantenimiento del circuito neural modificando las sinapsis y la excitabilidad neuronal. Estudios recientes han revelado la expresión génica diferencial y la heterogeneidad funcional de la microglía en diferentes regiones del cerebro. Las funciones únicas de la red neuronal del hipocampo en el aprendizaje y la memoria pueden estar asociadas con los roles activos de la microglía en la remodelación de la sinapsis. Sin embargo, las respuestas inflamatorias inducidas por procedimientos quirúrgicos han sido problemáticas en el análisis microscópico de dos fotones de la microglía del hipocampo. Aquí, se presenta un método que permite la observación crónica de la microglía en todas las capas del hipocampo CA1 a través de una ventana de imagen. Este método permite el análisis de cambios morfológicos en procesos microgliales durante más de 1 mes. Las imágenes a largo plazo y de alta resolución de la microglía en reposo requieren procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos, selección de lentes objetivas apropiadas y técnicas de imagen optimizadas. La respuesta inflamatoria transitoria de la microglía del hipocampo puede impedir la obtención de imágenes inmediatamente después de la cirugía, pero la microglía restaura su morfología quiescente en unas pocas semanas. Además, la obtención de imágenes de neuronas simultáneamente con la microglía nos permite analizar las interacciones de múltiples tipos de células en el hipocampo. Esta técnica puede proporcionar información esencial sobre la función microglial en el hipocampo.

Introduction

La microglía son las únicas células inmunes y macrófagos tisulares residentes en el cerebro. Además de sus funciones como células inmunes, como la respuesta rápida a la inflamación, se ha demostrado que desempeñan una variedad de funciones fisiológicas en el mantenimiento y la remodelación de los circuitos neuronales, como la poda sináptica, la regulación de la plasticidad sináptica y el control de la actividad neuronal 1,2,3,4,5 . Las interacciones fisiológicas entre la microglía y las neuronas son de creciente interés tanto en el desarrollo de circuitos neuronales como en la neurobiología de enfermedades. El análisis de la fisiología de la microglía in vivo requiere métodos para observar la microglía sin daño tisular y respuestas inflamatorias. Sin embargo, las microglías son sensibles a la inflamación y cambian drásticamente sus formas y funciones en respuesta al daño tisular 6,7.

Las imágenes in vivo de dos fotones son una herramienta ideal para capturar la dinámica fisiológica de la microglía8. Las aplicaciones iniciales de imágenes in vivo de dos fotones revelaron el movimiento dinámico de los procesos microgliales para la vigilancia ambiental en la corteza del ratón adulto 9,10. Los siguientes estudios de imagen de dos fotones ampliaron aún más el monitoreo in vivo de la microglía para el análisis de interacciones funcionales y estructurales con neuronas 5,11,12,13,14. Sin embargo, la profundidad de imagen de la microscopía convencional de dos fotones se ha limitado a menos de 1 mm de la superficie cerebral15,16. Esta restricción explica la escasez de estudios previos que informan sobre el comportamiento de la microglía en regiones cerebrales profundas, como el hipocampo.

Estudios recientes de secuenciación de ARN han revelado una considerable heterogeneidad regional de la microglía, aumentando la posibilidad de roles funcionales distintos 17,18,19,20,21. Por lo tanto, es necesario registrar las interacciones microgliales con las neuronas en varias regiones del cerebro, pero las dificultades técnicas han obstaculizado tales estudios. En particular, la participación activa microglial en la remodelación de la sinapsis ha sido reportada como crítica en el desarrollo de la red neuronal del hipocampo y sus funciones relacionadas con la memoria22,23. Sin embargo, no se dispone de métodos efectivos para observar in vivo la microglía del hipocampo no cuestionada.

Este protocolo explica los procedimientos para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el CA1 del hipocampo dorsal utilizando técnicas quirúrgicas controladas con precisión. Las imágenes de dos fotones del área CA1 en ratones CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), que expresan GFP en microglia24, permitieron la observación de la microglía ramificada en todas las capas del CA1 con suficiente resolución. El protocolo incluye varios consejos para la implantación exitosa de la ventana de observación y las condiciones de imagen apropiadas. Además, la visualización simultánea de neuronas piramidales y microglia en el CA1 se presenta como un ejemplo de aplicación. También se discuten las ventajas, limitaciones y potenciales de esta técnica.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo siguiendo las políticas del Comité de Ética Animal y el Comité de Seguridad de Experimentos Genéticos Recombinantes de la Universidad de Tokio. En los experimentos se utilizaron ratones CX3CR1-GFP machos y hembras, de 2 a 4 meses de edad. Para la seguridad de los experimentadores y el mantenimiento de las condiciones estériles, todos los procedimientos se realizaron con batas blancas, máscaras y guantes estériles. Todos los instrumentos fueron esterilizados antes de su uso. 1. Preparación de instrumentos y animales Ensamble un tubo metálico con fondo de vidrio (Figura 1A).Aplique una pequeña gota de adhesivo óptico de curado UV en un extremo de un tubo inoxidable hecho a medida (diámetro exterior 3,0 mm, diámetro interior 2,8 mm, altura 1,7 mm). Extienda el pegamento en el borde circular del tubo uniformemente.NOTA: Se debe usar una cantidad suficiente de adhesivo para cubrir todo el borde del tubo. Coloque un cubreobjetos de vidrio circular (3,0 mm de diámetro, 0,15 ± 0,02 mm de espesor) en el extremo cubierto de pegamento del tubo de metal, y presione ligeramente el cubreobjetos contra el tubo para que el espacio entre el tubo y el vidrio se llene con el pegamento. A continuación, ajuste la posición del vidrio para que quepa dentro del borde exterior del tubo de metal. Irradiar el vidrio con luz UV durante un tiempo suficiente para curar el adhesivo.NOTA: Asegúrese de que el vidrio y el tubo estén completamente conectados. Si la adhesión es insuficiente, el vidrio puede desprenderse después de la cirugía, lo que resulta en imágenes fallidas o fugas de líquido cefalorraquídeo (LCR). Desinfecte el tubo metálico con fondo de vidrio ensamblado con etanol al 70% y lávelo con solución salina estéril para eliminar los residuos. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de calor seco. Preparar ratones para la cirugía de implantación de ventanas.NOTA: Los ratones deben tener la edad adecuada. Es preferible que estén genéticamente modificados para expresar proteínas fluorescentes en el CA1 y el giro dentado (DG). Estos puntos se explican con más detalle en la sección Discusión. 2. Anestesia y fijación de la cabeza Anestesiar a un ratón mediante inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina). Administrar meloxicam (2 mg/kg) por inyección subcutánea para analgesia preoperatoria. Confirmar la desaparición de la respuesta a estímulos dolorosos, como pellizcar la cola para asegurar una profundidad adecuada de la anestesia. Agregue media dosis de ketamina-xilazina cada vez que la anestesia desaparezca durante la cirugía, generalmente 1 h después de la administración inicial y cada 30 minutos a partir de entonces. Use una almohadilla térmica debajo del cuerpo para proporcionar soporte térmico y aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.NOTA: La elección de la anestesia para la cirugía es esencial. Este punto se discute en detalle en la sección Discusión. Aplicar crema depilatoria para eliminar el vello del cuero cabelludo. Desinfecte el cuero cabelludo varias veces con un movimiento circular con exfoliante de povidona yodada seguido de alcohol. Coloque el ratón en la plataforma quirúrgica preparada con una almohadilla impermeable estéril y aplique cortinas estériles para asegurar el sitio quirúrgico. Luego, corte y retire el cuero cabelludo circularmente con un bisturí para que los huesos parietal y occipital queden completamente expuestos en el lado operatorio. Retire el tejido conectivo subcutáneo frotándolo con un hisopo de algodón mientras aplica solución salina estéril para eliminar el sangrado. Raspa suavemente la superficie craneal con un cuchillo miniatura de punta redonda para eliminar el periostio, que ayuda a fortalecer la adhesión entre el cemento y el hueso (ver paso 2.6). Aplique material de grabado dental en toda la superficie, espere decenas de segundos y enjuague con suficiente solución salina estéril. Usando tinta impermeable, marque el área del hueso a extirpar (un área circular con un diámetro de 3.0 mm, centrada aproximadamente 2.5 mm posterior y 2.5 mm lateral al bregma). Después de marcar, seque bien la superficie del cráneo.NOTA: La posición de la craneotomía depende del tamaño del hipocampo y debe optimizarse para diferentes edades. A continuación se presentarán indicadores útiles para la posición de la craneotomía (ver paso 3.4.5, NOTA). Fije la placa de aluminio rectangular con un grosor de 1.0 mm y con un orificio de 5.0 mm de diámetro en el centro al cráneo con cemento de resina dental de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Alinee cuidadosamente el orificio en el centro de la placa con el área circular marcada con un bolígrafo (ver paso 2.5) de modo que la placa de aluminio quede paralela a la superficie marcada del cráneo (Figura 1B). Asegúrese de que el cemento selle herméticamente todos los espacios entre la placa y el hueso. Espere unos 5 minutos para que el cemento esté suficientemente endurecido. Coloque el ratón sobre el dispositivo de sujeción de la cabeza con ajustadores de ángulo a través de la placa adjunta. 3. Implantación de la ventana de observación NOTA: Los siguientes procedimientos quirúrgicos deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico. Haga un surco circular en el cráneo usando un punzón dérmico con un diámetro de 3.0 mm. Alinee la ranura circular y el área marcada con un lápiz en el paso 2.5. Gire el punzón dérmico con una presión suave para que la profundidad de la ranura aumente gradualmente. Compruebe con frecuencia que la profundidad de la ranura sea constante en toda la circunferencia. Cuando el punzón dérmico alcance la capa más interna del cráneo, antes de tocar la duramadre subyacente, levante suavemente la isla ósea central con una aguja de 30 G.NOTA: Una ligera fuga de líquido desde la parte inferior de la ranura indica que la ranura está cerca de la duramadre. Retire la duramadre con un recolector de dura.NOTA: La extirpación completa de la duramadre dentro de la ventana craneal es necesaria y requerirá una resección cuidadosa de la duramadre residual en la periferia utilizando fórceps finos. Aspire suavemente el tejido para exponer el alvéo del hipocampo con agujas romas de 23 G o 25 G conectadas al aspirador.NOTA: Este paso es el más crítico para obtener imágenes exitosas. Los puntos técnicos clave para la aspiración de tejido se describen en detalle en la sección Discusión.Aspirar la pia y los vasos piales. Aspirar el tejido cortical de la superficie. Mantenga la profundidad de la superficie del tejido expuesto homogénea en toda la ventana craneal. Profundizar gradualmente la aspiración hasta que las fibras de la cápsula externa queden expuestas. Coloque cuidadosamente la punta de succión en la cápsula externa cerca del ventrículo lateral (VI) ubicado en el extremo rostrolateral de la ventana craneal. Retire la capa superficial de la cápsula externa que corre en la dirección caudomedial a rostrolateral, y luego la capa interna que corre en la dirección mediolateral.NOTA: La cápsula externa cerca del VI se puede quitar fácilmente de la estructura subyacente. Confirme la extracción de toda la cápsula externa comprobando la exposición completa de la superficie del alvéo y la comisura dorsal del hipocampo (DHC).NOTA: El DHC cubre la porción caudomedial del CA1. El alvéo y el DHC se pueden distinguir de la cápsula externa por sus orientaciones de fibra. Es decir, las fibras dentro del alvéo y el DHC corren en la dirección rostromedial a caudolateral, y se pueden distinguir de las fibras en la cápsula externa. El alvéo y el DHC están fuertemente unidos al CA1 y no deben dañarse. Todos los fragmentos de la cápsula externa deben eliminarse, ya que cualquier fragmento restante evitará el contacto directo del cubreobjetos de vidrio con el alvéo. Confirme que el sangrado se ha detenido completamente y llene el orificio con solución salina estéril hasta el nivel de la superficie del cráneo.NOTA: El campo de visión aquí ayuda a juzgar si el orificio está en la posición adecuada para la edad específica del ratón. Idealmente, el alvéo y el CA1 subyacente deberían ocupar la mayor parte del área central. Una parte del DHC es visible en el área caudomedial. La abertura del VI es detectable en el borde rostrolateral (Figura 3A). Inserte el tubo metálico con fondo de vidrio (ver paso 1.1) verticalmente en el orificio mientras aspira el exceso de agua que se desborda desde los lados del tubo hasta que el fondo de vidrio presione ligeramente contra el alvéo y aplane parcialmente el CA1 subyacente.NOTA: Esta presión debe ajustarse adecuadamente. Si es demasiado fuerte, el CA1 se dañará. Si es demasiado débil, la aberración esférica debida a la curvatura del CA1 perjudicará la resolución de imágenes en estructuras profundas. Usando cemento de resina dental, fije la pared del tubo insertado al cráneo circundante (Figura 1C). Asegúrese de que toda la circunferencia esté herméticamente sellada y que no haya fugas de aire o LCR. Espere unos 5 minutos para que el cemento se endurezca.NOTA: Si el cemento se coloca cuando su viscosidad es baja, puede filtrarse en el parénquima cerebral a través del espacio entre el tubo y el cráneo y dañar el cerebro. Por lo tanto, el cemento debe aplicarse después del inicio de la polimerización, lo que aumenta la viscosidad y reduce las fugas a través del espacio. Lave toda la placa, el cráneo y el interior del tubo con solución salina estéril para eliminar los desechos. 4. Microscopía de dos fotones inmediatamente después de la cirugía para el control de calidad de la cirugía Coloque el ratón en el dispositivo de sujeción de la cabeza debajo de la lente del objetivo del microscopio de dos fotones y en la etapa de escaneo XY motorizada. Use una almohadilla térmica para soporte térmico. Controle y ajuste la profundidad de la anestesia como se describe en el Paso 2.1, ya que este control de calidad puede tardar hasta 30 minutos.NOTA: Se recomienda el objetivo de inmersión en agua con una distancia de trabajo (WD) superior a 3 mm y una alta apertura numérica (NA). Un collar de corrección de la lente del objetivo puede mejorar la resolución al compensar el desajuste del índice de refracción entre el vidrio y los biomateriales. Llene el espacio entre el vidrio y la lente del objetivo con agua, teniendo especial cuidado para evitar burbujas de aire. Si es necesario, expanda el área de la placa de metal con una película de plástico, que contiene más agua, para cubrir toda la lente frontal del objetivo. Encienda un láser pulsado de femtosegundos de longitud de onda de 920 nm para la excitación de las sondas fluorescentes expresadas en el cerebro e inicie el software de adquisición de imágenes. Ajuste el enfoque al CA1 con el uso de la platina motorizada y el sistema de enfoque motorizado. Coloque la estructura objetivo con la guía de la fluorescencia emitida por el parénquima cerebral y la luz reflejada desde el borde del tubo metálico bajo iluminación continua por el láser pulsado. Mida las profundidades del parénquima cerebral tocando el fondo de vidrio ajustando el enfoque con el sistema de enfoque motorizado. Compare las profundidades en diferentes ubicaciones horizontales para juzgar la alineación del fondo de vidrio y el plano de imagen.Ajuste el ángulo de la cabeza del ratón inclinando el dispositivo de sujeción de la cabeza hasta que el fondo del cristal esté configurado para que esté paralelo al plano de imagen. Ajuste el collar de corrección del objetivo para lograr la resolución más alta a la profundidad de la estructura objetivo en el CA1. Confirme que las células fluorescentes en la capa molecular (ML) de la hoja superior DG a una profundidad de 500 μm desde el fondo del vidrio se pueden visualizar en todo el campo de visión.NOTA: Este paso es importante para juzgar la calidad de la cirugía. Si el CA1 está dañado, el edema cerebral focal impide la detección de fluorescencia a una profundidad de más de 200 μm de la superficie. Solo cuando no hay daño en el CA1, y la curvatura de las capas de CA1 se aplana adecuadamente por el cubreobjetos suprayacente, las señales DG se pueden detectar inmediatamente después de la cirugía (Figura 2A-D). La sección Resultados representativos proporciona una manera sencilla de determinar el límite entre el CA1 y el DG. 5. Cuidados postoperatorios Aspire el agua dentro del tubo y cúbralo con un sello de plástico para evitar que entren residuos. Mantenga al ratón caliente y espere la recuperación de la anestesia. Administrar meloxicam (2 mg/kg) por vía subcutánea cada 24 h siempre y cuando el ratón muestre un comportamiento relacionado con el dolor. Elevar el ratón postoperatorio en una carcasa individual durante varias semanas. 6. Imágenes crónicas in vivo de dos fotones de microglia utilizando ratones CX3CR1-GFP Después de la inducción de la anestesia, lave el interior del tubo de metal con solución salina estéril para eliminar los residuos. Asegúrese de que el alvéo blanco del hipocampo sea visible a través del vidrio (Figura 3A) y que no haya complicaciones como sangrado postoperatorio. Coloque el ratón bajo el microscopio de dos fotones siguiendo los pasos 4.1 a 4.6. Comprobar la calidad e intensidad de las imágenes obtenidas por la excitación de dos fotones del hipocampo (Figura 3B). Asegúrese de que las imágenes tomadas después de la reducción del edema postoperatorio sean comparables o mejores que las tomadas el día de la cirugía (Figura 2A, ver paso 4.5).NOTA: El deterioro de la imagen indica la presencia de daño tisular dentro del cerebro. Asegúrese de que la microglía ya haya recuperado su morfología ramificada (Figura 3C).NOTA: Los datos de imágenes de la microglía indican que se requieren al menos 3-4 semanas para que la microglía vuelva a su estado basal. Realizar imágenes in vivo en cualquier capa del CA1 para el propósito particular del experimento.

Representative Results

Usando esta técnica, la microglía ramificada y quiescente se puede observar crónicamente dentro de todas las capas del CA1 dorsal, incluyendo el estrato oriens (SO), el estrato piramidal (SP), el estrato radiático (SR) y el estrato lacunosum-moleculare (SLM), especialmente 3-4 semanas después de la cirugía cuando la inflamación disminuye. Si la cirugía se realiza adecuadamente, las imágenes se pueden realizar hasta varios meses después de la cirugía. Esta sección contiene tres temas útiles para la evaluación de imágenes intravitales. En primer lugar, las imágenes de muestra inmediatamente después de la cirugía y en la fase crónica se proporcionan como referencias para los procedimientos quirúrgicos y de imagen apropiados. En segundo lugar, se describe la morfología distinta de la microglía, su intensidad de fluorescencia y la distribución de los vasos sanguíneos en capas específicas del hipocampo para ayudar a los lectores a estimar la profundidad de imagen que va desde el alveo hasta el DG. En tercer lugar, se proporciona un ejemplo de aplicación que ilustra imágenes simultáneas de neuronas y microglia. Las imágenes representativas de la microglía en ratones CX3CR1-GFP inmediatamente después de la cirugía se muestran en la Figura 2. Si no hay daño aparente en el CA1 y la curvatura de las capas de CA1 se aplana adecuadamente por el cubreobjetos suprayacente, las profundidades de imagen de dos fotones de la microglía exceden todas las capas de CA1 y alcanzan los 500 μm de la superficie quirúrgica, donde existe el ML o la capa de células granulares (GCL) del DG (Figura 2A; ver paso 4.7 y Figura 4E). Las microglías están ligeramente menos ramificadas, especialmente en la capa cercana a la superficie quirúrgica en comparación con las del hipocampo intacto. Sin embargo, no presentan una activación prominente, lo que sugiere procedimientos quirúrgicos adecuados (Figura 2B). Por otro lado, el edema en el CA1 inducido por daño tisular limitará la profundidad de imagen a 200 μm (Figura 2C). El daño tisular también induce una activación microglial anormal, como la acumulación de procesos abultados hacia la superficie del tejido libre (Figura 2D; comparar con la imagen superior de la Figura 2B). Estos son signos de cirugía inapropiada. Las imágenes representativas de la microglía en la fase crónica más de 3 semanas después de la cirugía se muestran en la Figura 3. La microglía puede ser fotografiada de nuevo más allá del CA1 a las capas más profundas de la DG con mayor intensidad fluorescente y resolución y con una distribución más homogénea (ver paso 6.3, Figura 3B). La calidad de las imágenes es mejor que la inmediatamente después de la cirugía (Figura 2A). Esta diferencia puede explicarse por la reducción del edema y la inflamación. La microglía en todas las capas ya ha restaurado su morfología ramificada (Figura 3C), diferente de su apariencia postoperatoria (Figura 2B). Las imágenes de lapso de tiempo de la microglía en el CA1 revelan los cuerpos celulares inmóviles y los procesos altamente móviles para la vigilancia (Video 1-2). Su comportamiento móvil es similar al informe anterior de la dinámica del proceso microglial en la corteza9. Es sencillo especificar las capas del hipocampo fotografiadas en función de la distribución y la profundidad de los cuerpos celulares neuronales, utilizando ratones que expresan sondas fluorescentes en las neuronas del hipocampo25,26,27. Sin la ayuda de la información posicional sobre los cuerpos celulares de las neuronas, las señales de la microglía fluorescente por sí solas proporcionan algunas pistas para la identificación de las capas del hipocampo (Figura 3B). La microglía en el alvéo tiene cuerpos celulares alargados y procesos que tienden a extenderse a lo largo de los tractos axonales (Figura 4A). La microglía en otras capas se puede distinguir por sus cuerpos celulares redondos y procesos que irradian sin direcciones preferidas. La microglía en SP se encuentra entre las neuronas piramidales densamente empaquetadas y se puede distinguir por la menor densidad de los procesos microgliales. Las capas por encima y por debajo de SP se identifican como SO y SR, respectivamente (Figura 4B). Es imposible distinguir entre SR y SLM basándose únicamente en las propiedades microgliales. El borde entre el CA1 y el DG es reconocido por vasos sanguíneos gruesos que corren a lo largo del límite (Figura 4C). Estos vasos pueden reconocerse mejor marcando los vasos con colorantes como sulforhodamine 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g de peso corporal) inyectados por vía intraperitoneal (Figura 4D). La señal de fluorescencia de la microglía cae bruscamente en el DG en comparación con el CA1 suprayacente, probablemente debido a la diferencia en el índice de refracción de estas estructuras. Esta brecha en la intensidad de fluorescencia también puede ayudar a especificar el límite entre el DG y el CA1. Como ejemplo de aplicación, se muestran imágenes simultáneas de microglía GFP positiva y neuronas piramidales marcadas con tdTomato (Figura 4E). En este experimento, los ratones CX3CR1-GFP recibieron una inyección de virus adenoasociado (AAV) para la expresión de tdTomato en las neuronas piramidales del hipocampo. El etiquetado neuronal ayudará a comprender las estructuras exactas de las capas del CA1. Figura 1: Dibujos esquemáticos para la implantación de la ventana de observación . (A) Vista transversal del tubo metálico con fondo de vidrio ensamblado. Un cubreobjetos de vidrio circular se adhiere a un extremo del tubo cilíndrico de acero inoxidable. (B) Vista transversal de la placa de aluminio unida al cráneo. La placa debe estar paralela a la superficie marcada del cráneo para no interferir con la lente del objetivo, colocada cerca de la placa para enfocar. (C) Vista transversal del tubo implantado. El fondo de vidrio debe estar estrechamente unido al alveo del hipocampo para presionar y aplanar suavemente la superficie del CA1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Imágenes in vivo de microglia en ratones CX3CR1-GFP inmediatamente después de la cirugía. (A) Reconstrucción 3D representativa a partir de la imagen CA1 in vivo de un ratón CX3CR1-GFP en el día postoperatorio (POD) 0 (ancho: 511 μm, altura: 511 μm, profundidad: 550 μm). La microglía fluorescente en el ML del DG a una profundidad de 500 μm desde el fondo del vidrio se puede visualizar a través de todo el CA1. (B) La microglía típica rellena de GFP obtenida en (A) se muestra como las proyecciones de intensidad máxima (MIP) de las pilas de imágenes con un espesor de 20 μm a profundidades de 100, 300 y 520 μm desde el fondo del vidrio. La morfología microglial es detectable desde el CA1 superficial hasta el ML del DG, aunque con un aparente deterioro de la imagen en el DG. La microglía, especialmente en la capa cercana a la superficie quirúrgica, está menos ramificada pero no exhibe una activación obvia. Barras de escala, 50 μm. (C) Reconstrucción representativa de imágenes 3D del CA1 dañado quirúrgicamente. Los datos se adquirieron de un ratón CX3CR1-GFP en POD 0 (ancho: 399 μm, altura: 399 μm, profundidad: 450 μm). La fluorescencia microglial es detectable sólo hasta la profundidad de 200 μm, en contraste con el CA1 (A) no dañado con microglia fluorescente detectada a una profundidad de 500 μm. (D) La imagen típica de microglia anormalmente activada en (C). El MIP de las pilas de imágenes GFP con un espesor de 20 μm a una profundidad de 60 μm muestra procesos de abultamiento microglial que se extienden hacia la superficie del tejido expuesto quirúrgicamente. La morfología microglial general es diferente de la imagen que se muestra en (B). Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Imagen in vivo de la microglía en ratones CX3CR1-GFP en fase crónica. (A) La apariencia representativa de la ventana implantada en el CA1 dorsal derecho en la fase crónica. A través del fondo de vidrio, las fibras blancas del alvéo se observan claramente sin sangrado postoperatorio. El DHC y el VI son parcialmente visibles en el área caudomedial y en el borde rostrolateral, respectivamente. Barra de escala, 1 mm. (B) Reconstrucción 3D representativa de la imagen CA1 crónica in vivo de un ratón CX3CR1-GFP en POD 24 (ancho: 511 μm, altura: 511 μm, profundidad: 670 μm). En comparación con las imágenes inmediatamente después de la cirugía (Figura 2A), la microglía muestra una distribución más homogénea y se puede observar más claramente en las capas más profundas de la DG debido a la reducción del edema y la inflamación. (C) Las imágenes típicas de microglia de (B) con morfología ramificada completamente restaurada se muestran como MIP de pilas de imágenes GFP con 20 μm de espesor a profundidades de 100, 280 y 500 μm de la superficie quirúrgica. Barras de escala, 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Pistas para identificar cada capa del hipocampo durante la obtención de imágenes in vivo y un ejemplo de aplicación de este método. (A) La imagen típica de microglia en el alvéo de ratones CX3CR1-GFP en la fase crónica. Los cuerpos y procesos de células microgliales que se extienden a lo largo de los tractos axonales se muestran en el MIP de las pilas de imágenes GFP con un espesor de 10 μm a una profundidad de 15 μm. Barra de escala, 50 μm. (B) Imágenes representativas de la microglía en SO, SP y SR en la fase crónica mostradas como el MIP de las pilas de imágenes GFP con 5 μm de espesor. La densidad local de los procesos microgliales es menor en SP que en SO o SR circundantes debido a las neuronas piramidales densamente empaquetadas en SP. Barras de escala, 100 μm. (C) Los vasos sanguíneos gruesos que corren a lo largo del límite entre el CA1 y el DG solo pueden reconocerse por la fluorescencia microglial. Se muestra la proyección de intensidad media de las pilas de imágenes GFP en mosaico con un espesor de 90 μm en la fase crónica a una profundidad de aproximadamente 500 μm. El vacío de la señal GFP corresponde a los recipientes gruesos. Barra de escala, 500 μm. (D) (Superior) Imagen del mismo campo de visión que C después de la inyección intraperitoneal de SR101. Barra de escala, 500 μm. (inferior) Reconstrucción 3D de las imágenes en mosaico después de la inyección SR101 (ancho: 2,60 mm, altura: 1,73 mm, profundidad: 0,69 mm). Los vasos gruesos que corren a lo largo de la frontera entre el CA1 y el DG pueden reconocerse fácilmente por la fluorescencia intravascular SR101. (E) (Izquierda) reconstrucción 3D del CA1 y el DG (ancho: 255 μm, altura: 255 μm, profundidad: 730 μm) y (derecha) el MIP de GFP y tdTomato fluorescencia en SP hecha de pilas de imágenes con 20 μm de espesor. A 1 semana antes de la cirugía, se inyectaron 1,5 μL de una mezcla de AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 vg/ml) y AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 vg/ml) en el hipocampo de un ratón CX3CR1-GFP para marcar las neuronas escasamente. Las imágenes se realizaron en POD 0. SP y GCL se reconocen fácilmente por la posición de los cuerpos celulares neuronales. Barra de escala, 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Video 1: Imágenes de lapso de tiempo de la microglía SO en la fase crónica. El MIP de GFP se apila con un grosor de 20 μm en las imágenes de lapso de tiempo de la microglía SO, animadas para que 28 minutos se reproduzcan en 1 seg. Barra de escala, 50 μm. Haga clic aquí para descargar este video. Video 2: Imágenes de lapso de tiempo de la microglía SR en la fase crónica. El MIP de GFP se apila con un grosor de 20 μm en la imagen de lapso de tiempo de la microglía SR, animada para que 28 minutos se reproduzcan en 1 seg. Barra de escala, 50 μm. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

Este método contiene procedimientos quirúrgicos elaborados, pero puede proporcionar imágenes de alta resolución en todo el CA1 durante un período prolongado si se prepara adecuadamente. Los experimentos con varios ratones confirmaron que la calidad de imagen en la fase postoperatoria crónica es mejor que la de las imágenes postoperatorias agudas. La mejor calidad de imagen se mantuvo durante más de 2 meses. La causa más común de fracaso es el daño no intencional al CA1 durante la cirugía, que se identifica en el control de calidad postoperatorio (ver paso 4). Esto puede deberse a una lesión directa por aspiración, secado del cerebro, presión excesiva por el vidrio o toxicidad del cemento dental en el paso final. Otra causa de fracaso es el sangrado postoperatorio, que puede confirmarse a través de la ventana con fondo de cristal dentro de 1 semana después de la cirugía (ver paso 6.1). Lea el protocolo cuidadosamente y tome todas las precauciones para evitar tales problemas.

Incluso con la configuración actual del microscopio de dos fotones con detectores GaAsP en el laboratorio, el intento de obtener imágenes del CA1 dorsal a través de la corteza resulta en una pérdida significativa de resolución debido a la dispersión no despreciable de la luz. Por lo tanto, para obtener la resolución suficiente para observar el movimiento de los procesos microgliales o la formación de espinas dendríticas de las neuronas en el CA1, la eliminación de una parte de la corteza suprayacente es inevitable, como en el método actual. La única forma alternativa de reducir el alcance de la extirpación cortical mientras se mantiene una alta resolución de imagen es incrustar una lente de relé, como una lente de índice de refracción de gradiente (GRIN). En este enfoque, se ha colocado una lente GRIN dentro de un tubo guía implantado directamente sobre el CA1 para imágenes crónicas de CA128,29. El diámetro exterior del tubo guía era de 1,8 mm, que es más pequeño que los 3,0 mm del dispositivo en este documento, mientras que produce alta resolución (NA; 0,82) comparable al sistema aquí (NA efectiva; 0,88). Sin embargo, el enfoque que utiliza una lente GRIN tiene un campo de visión estrecho para la observación de alta resolución y una profundidad de imagen corta limitada por el WD de la lente GRIN. Por lo tanto, obtener imágenes de todas las capas del hipocampo en un amplio campo de visión con alta resolución es una ventaja específica del método en este documento.

Una limitación de este procedimiento es que la eliminación parcial de la corteza y la inflamación pueden tener algunos efectos perjudiciales en el hipocampo. Sin embargo, debido a que la corteza eliminada no tiene entrada directa al hipocampo, la corteza entorrinal no está dañada y el hipocampo en sí no está directamente lesionado, la evaluación general es que el deterioro funcional del hipocampo no es significativo. Varios estudios previos han confirmado que las funciones del hipocampo, incluyendo el aprendizaje y la memoria, se conservan después de la implantación de la ventana del hipocampo 25,26,27,30,31,32,33,34. Por lo tanto, se espera que el enfoque de imagen descrito aquí informe fielmente las funciones del hipocampo después de un período postoperatorio suficiente.

Las direcciones futuras de los sujetos de investigación basadas en esta técnica de imagen pueden incluir la poda sináptica detectada por imágenes simultáneas de microglia y neuronas5, la interacción microglial relacionada con el aprendizaje con las sinapsis35, la motilidad microglial regulada por la actividad neural del hipocampo36 y las respuestas microgliales a la inflamación periférica o al daño tisular7. Este método también ayudará a dilucidar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer (EA), las proteínas amiloide β y tau se acumulan en paralelo con las muertes de células neuronales y la atrofia del hipocampo, lo que lleva a la disfunción cognitiva; Se ha descrito que la microglía está involucrada en este proceso37,38. Las imágenes crónicas in vivo de microglia y neuronas utilizando los modelos de ratón AD nos permitirán monitorear la correlación entre las funciones microgliales y la patología neuronal en el hipocampo de los modelos de ratón AD.

Este documento se centra en las imágenes microgliales, pero el mismo procedimiento de imagen es aplicable a los otros tipos de células neuronales y gliales en el CA1. Además, el protocolo se limita a la obtención de imágenes de ratones anestesiados, pero la técnica también se puede extender a la monitorización de la microglía del hipocampo en ratones despiertos. Los artefactos de movimiento inducidos por la respiración, los latidos del corazón y los movimientos corporales, especialmente en las capas profundas del hipocampo lejos de la ventana de vidrio, pueden existir en experimentos con ratones despiertos. Por lo tanto, puede ser necesario un sistema de corrección de movimiento apropiado para capturar la morfología y dinámica microglial.

Debate relacionado con el Protocolo
Es aconsejable seleccionar ratones de edad apropiada y modificaciones genéticas para la expresión de sondas fluorescentes con especificidad temporal y espacial (ver paso 1.3). Los ratones de 1 mes de edad se pueden usar para experimentos, pero los ratones mayores de 2 meses son más fáciles de manejar, con su mayor tamaño corporal y resistencia al estrés quirúrgico. Además, la cápsula externa y el alvéo del hipocampo son más difíciles de separar en ratones más jóvenes. Por lo tanto, la extracción de la cápsula externa en ratones jóvenes requiere habilidades quirúrgicas (ver pasos 3.4.3-4). La evaluación de la cirugía y las imágenes posteriores serán más sencillas con ratones que expresen proteínas fluorescentes de forma reproducible y uniforme en el CA1 y el DG (ver paso 4.7). Por lo tanto, en los ensayos iniciales de la cirugía, es aconsejable utilizar ratones transgénicos con neuronas escasamente marcadas, como los ratones Thy1-YFP o Thy1-GFP39, o ratones con microglía marcada, como los ratones CX3CR1-GFP24.

Para una cirugía exitosa, la elección de la anestesia es importante (ver paso 2.1). Los diferentes tipos de anestesia pueden causar varios grados de edema cerebral intraoperatorio, que afectan la dificultad de la cirugía, la posición relativa del tubo de metal implantado y el grado de compresión cerebral por la ventana de vidrio. Estos factores también pueden influir en la supervivencia de las neuronas del hipocampo después de la cirugía.

En el proceso de aspiración para exponer el hipocampo (ver paso 3.4), se deben tener en cuenta los siguientes puntos para minimizar el daño al cerebro y garantizar una imagen exitosa. Suministre constantemente solución salina estéril sobre la superficie del tejido colocando una salida al lado de la ventana craneal. Evite que la superficie del tejido se exponga al aire durante la aspiración. El principio básico de la aspiración de tejido es eliminar la superficie del tejido mediante un flujo de líquido en la punta de succión. Debe evitarse el contacto directo de la punta de succión con el tejido. Ajuste la presión negativa aplicada al tubo de succión para que sea mínima. Aspire el tejido paso a paso y confirme que el sangrado se controla en cada paso. Cuando el sangrado es prolongado, espere hasta que el sangrado se detenga espontáneamente. Mantenga la aspiración a poca distancia del punto de sangrado con un flujo constante de solución salina estéril. Aspirar el tejido para crear un espacio cilíndrico con su tamaño ajustado al tubo metálico con fondo de vidrio (ver paso 1.1). Elija agujas de 23 G para aspirar vasos piales gruesos o fragmentos de tejido grandes y agujas de 25 G para succionar restos de tejido pequeños.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a M. Kondo y M. Matsuzaki por prestarnos el objetivo XLPLN25XSVMP. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) por Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 a R.K.) y Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 a S.O.), de la Agencia Japonesa para la Investigación y Desarrollo Médico (JP19gm1310003 y JP17gm5010003 a S.O.), y de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón por Moonshot R&D (JPMJMS2024 a H.M.).

Materials

23 G blunt needles NIPRO 02-166 Suction tips for aspiration.
25 G blunt needles NIPRO 02-167 Suction tips for aspiration.
3 mm dermal punches (DermaPunch) Maruho 213001610 Tools for craniotomy.
30 G needles Dentronics Disposable needle No. 30 Tools for craniotomy.
A femtosecond pulsed laser Spectra-Physics MaiTai Deep See A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.
A two-photon microscope Nikon A1R MP+ Microscope for the CA1 imaging.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
AAV1-hSyn-Cre Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
An objective lens for two-photon imaging Olympus XLPLN25XSVMP 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar
Aspirators Shin-ei Industries KS-500 Tools for aspiration.
Aluminum plates Narishige CP-1 Plates made of alminum for head fixation.
Chemical depilatory cream YANAGIYA Cream for hair removal around the surgical site.
Circular glass coverslips Matsunami Glass 3φ No.1 Coverslips bonded to stainless steel tubes.
CX3CR1-GFP mice The Jackson Laboratory 008451 Transgenic mice for microglial imaging.
Cylindrical stainless steel tubes MORISHITA Custom-made Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.
Dental etching material Sun Medical 204610461 Used to etch the skull bones.
Dental resin cement (Super-Bond C&B) Sun Medical 204610555 Dental cement.
Dura pickers (Micro Points) Fine Science Tools 10063-15 Tools for dura removal.
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11252-20 Surgical tools.
Forceps Bio Research Center PRI13-3374 Used to disinfect the surgical site.
Head holding device Narishige MAG-2 The head holding device of mice with angle adjusters
Heating pad Bio Research Center BWT-100A and HB-10 Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.
Heating pad ALA Scientific HEATINGPAD-1 and Hot-1 Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.
Ketamine (Ketalar) Daiichi Sankyo Company S9-001665 Anesthesia during surgery.
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959 Analgesia during surgery.
Ophthalmic ointment Sato Pharmaceutical Used to prevent eye dryness during surgery.
Povidone-iodine scrub solution Meiji Seika Pharma 2612701Q1137 Used to disinfect the surgical site.
Round-tipped miniature knives Surgistar 4769 Surgical tools.
Scalpel MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS 450-098-67 Disposable surgical tool.
Stereo microscopes Leica Microsystems S8 APO Microscopes for surgery.
Sterile saline Otsuka Pharmaceutical Factory 3311401A2026 Washing solution during surgery.
Sterile waterproof pad AS ONE 8-5945-01 Surgical platform.
Sulforhodamine 101 Sigma-Aldrich S7635 A dye for in vivo vessel imaging.
Surgical drape Medline Industries MP-0606F6T Perforated drape for surgery.
UV light Toshiba GL15 Used to cure the adhesives.
UV-curing optical adhesives Thorlabs NOA81 Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.
Xylazine (Celactal 2%) Bayer Anesthesia during surgery.
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Riferimenti

  1. Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. Microglia in physiology and disease. Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).
  2. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
  3. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  4. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
  5. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).
  8. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  10. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  11. Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).
  12. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540 (2016).
  13. Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).
  14. Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
  15. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  16. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
  18. De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
  19. Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
  20. Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
  21. Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
  22. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  23. Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
  26. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  27. Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
  28. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
  29. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  30. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  31. Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  32. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  33. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  34. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  35. Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  36. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  37. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  38. Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).
  39. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).

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Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (185), e64104, doi:10.3791/64104 (2022).
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