体内 小鼠海马体中小胶质细胞的慢性双光子成像

所有动物实验均按照东京大学动物伦理委员会和基因重组实验安全委员会的政策批准和进行。实验中使用了2-4个月的雄性和雌性CX3CR1-GFP小鼠。为了实验人员的安全和无菌条件的维持，所有程序都使用白大褂，口罩和无菌手套进行。所有器械在使用前都经过消毒。 1. 仪器和动物的准备 组装玻璃底金属管（图1A）。将一小滴紫外线固化光学粘合剂涂在定制不锈钢管的一端（外径 3.0 毫米、内径 2.8 毫米、高度 1.7 毫米）。将胶水均匀地涂在管子的圆形边缘上。注意：应使用足够量的粘合剂来覆盖管子的整个边缘。 将圆形玻璃盖玻片（直径3.0毫米，厚度0.15±0.02毫米）放在金属管的胶水覆盖端，然后将盖玻片轻轻按压在管子上，使管子和玻璃之间的间隙充满胶水。接下来，调整玻璃的位置以适合金属管的外边缘。 用紫外线照射玻璃足够的时间以固化粘合剂。注意：确保玻璃和管子完全连接。如果粘附力不足，玻璃可能会在手术后脱落，导致成像不成功或脑脊液 （CSF） 泄漏。 用70%乙醇消毒组装好的玻璃底金属管，并用无菌盐水洗涤以去除碎屑。 用干热灭菌器对所有手术器械进行消毒。 为窗户植入手术准备小鼠。注意：小鼠应达到适当的年龄。优选的是，它们经过基因工程改造以表达CA1和齿状回（DG）中的荧光蛋白。这些要点将在讨论部分进一步解释。 2.麻醉和头部固定 通过腹膜内注射氯胺酮 – 甲苯噻嗪（100mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪）麻醉小鼠。皮下注射美洛昔康（2mg / kg）用于术前镇痛。确认对疼痛刺激的反应消失，例如尾部捏，以确保足够的麻醉深度。每次麻醉在手术过程中消失时加入半剂量的氯胺酮 – 甲苯噻嗪，通常在初始给药后1小时，此后每30分钟一次。在身体下方使用加热垫提供热支持，并在眼睛上涂抹眼药膏以防止麻醉下干燥。注意：手术麻醉的选择至关重要。这一点在讨论部分有详细讨论。 涂抹脱毛膏去除头皮上的毛发。用聚维酮碘磨砂膏和酒精以圆周运动对头皮进行几次消毒。将鼠标放在用无菌防水垫准备的手术平台上，并应用无菌布以确保手术部位。然后，用手术刀圆形切割并去除头皮，使顶骨和枕骨完全暴露在手术侧。 用棉签擦拭皮下结缔组织，同时涂抹无菌盐水以清除出血，从而去除皮下结缔组织。用圆头微型刀轻轻刮擦颅面以去除骨膜，这有助于加强水泥和骨骼之间的粘附（见步骤2.6）。 将牙科蚀刻材料涂在整个表面上，等待数十秒，然后用足够的无菌盐水冲洗。 使用防水墨水标记要去除的骨骼区域（直径为3.0毫米的圆形区域，中心距后方约2.5毫米，后部约2.5毫米，后侧约2.5毫米）。标记后，彻底擦干颅骨表面。注意：开颅术的位置取决于海马体的大小，应针对不同的年龄进行优化。下面将介绍开颅术位置的有用指标（见步骤3.4.5，注）。 根据制造商的说明，使用牙科树脂水泥将厚度为1.0毫米，中心有一个直径为5.0毫米的孔的矩形铝板连接到头骨上。小心地将板中心的孔与用笔标记的圆形区域对齐（见步骤2.5），使铝板平行于头骨的标记表面（图1B）。确保水泥紧紧密封板和骨头之间的所有间隙。等待约5分钟，使水泥充分硬化。 通过附加的板 将 鼠标放在带有角度调节器的头部固定装置上。 3.观察窗的植入 注意：以下外科手术应在体视显微镜下进行。 使用直径为3.0毫米的真皮冲头在头骨上做一个圆形凹槽。在步骤 2.5 中对齐圆形凹槽和用笔标记的区域。用轻轻的压力扭转真皮冲头，使凹槽深度逐渐增加。经常检查凹槽深度在整个圆周上是否恒定。 当真皮冲头到达颅骨的最内层时，在接触下面的硬脑膜之前，使用 30 G 针轻轻抬起中央骨岛。注意： 凹槽底部有轻微液体泄漏，表明凹槽靠近硬脑膜。 使用硬脑膜拾取器取出硬脑膜。注意：完全去除颅窗内的硬脑膜是必要的，并且需要使用细镊子小心地切除外围的残余硬脑膜。 轻轻吸出组织，通过连接到吸引器的 23 G 或 25 G 钝针暴露海马肺泡。注：此步骤对于成功映像最为关键。组织抽吸的关键技术要点在讨论部分有详细说明。吸出软脑膜和软脑膜血管。 从表面吸出皮质组织。在整个颅窗上保持暴露组织表面的深度均匀。逐渐加深抽吸，直到外囊的纤维暴露出来。 小心地将吸头放在颅窗前外侧端的侧脑室 （LV） 附近的外囊上。去除沿尾状向前外侧方向运行的外囊表层，然后去除沿中外侧方向运行的内层。注意：LV附近的外部话筒头可以很容易地从底层结构中移除。 通过检查肺泡表面和背海马连合（DHC）的完全暴露来确认整个外部胶囊的去除。注意：DHC 覆盖 CA1 的尾部。肺泡和DHC可以通过它们的纤维取向与外部胶囊区分开来。也就是说，肺泡内的纤维和DHC沿前内侧到尾外侧方向运行，并且可以与外部胶囊中的纤维区分开来。肺泡和DHC紧紧地附着在CA1上，不应损坏。应去除外部胶囊的所有碎片，因为任何剩余的碎片都会阻止玻璃盖玻片与肺泡的直接接触。 确认出血已彻底停止，并用无菌盐水填充孔至颅骨表面的水平。注意：此处的视野有助于判断孔是否处于适合鼠标特定年龄的位置。理想情况下，肺泡和下面的CA1应占据中心区域的大部分。DHC的一部分在尾状区域可见。左心室的开口可在前外侧边缘检测到（图3A）。 将玻璃底金属管（见步骤1.1）垂直插入孔中，同时吸出从管子侧面溢出的多余水，直到玻璃底部轻轻压在肺泡上并部分压平下面的CA1。注意：此压力需要适当调整。如果太强，CA1会损坏。如果太弱，由于CA1曲率引起的球差将损害深层结构的成像分辨率。 使用牙科树脂水泥，将插入管的壁固定在周围的颅骨上（图1C）。确保整个圆周密封严密，没有空气或脑脊液泄漏。等待约5分钟，让水泥硬化。注意：如果水泥在其粘度低时放置，它可能会通过管子和颅骨之间的间隙泄漏到脑实质中并损害大脑。因此，水泥应在聚合引发后应用，这样可以增加粘度并减少通过间隙的泄漏。 用无菌盐水清洗整个板、颅骨和管内以去除碎屑。 4. 手术后立即进行双光子显微镜检查，以检查手术质量 将鼠标放在双光子显微镜物镜下的头部固定装置中，并放在电动XY扫描载物台上。使用加热垫进行热支撑。如步骤2.1中所述监测和调整麻醉深度，因为此质量检查可能需要长达30分钟。注意：建议使用工作距离（WD）大于3 mm且数值孔径（NA）较高的水浸物镜。物镜的校正环可以通过补偿玻璃和生物材料之间的折射率不匹配来提高分辨率。 用水填充玻璃和物镜之间的空间，特别注意避免气泡。如有必要，使用可容纳更多水的塑料薄膜扩大金属板的面积，以覆盖物镜的整个前透镜。 打开920nm波长的飞秒脉冲激光器以激发大脑中表达的荧光探针并启动图像采集软件。 使用电动载物台和电动对焦系统将焦点调整到 CA1。在脉冲激光的连续照明下，在脑实质发出的荧光和金属管边缘的反射光的引导下定位目标结构。 通过使用电动对焦系统调整焦点来测量接触玻璃底部的脑实质的深度。比较不同水平位置的深度，以判断玻璃底部和成像平面的对齐情况。通过倾斜头部固定装置来调整鼠标头的角度，直到将玻璃底部设置为平行于成像平面。 调整物镜的校正环，以在CA1中目标结构的深度处实现最高分辨率。 确认DG上叶片分子层（ML）中的荧光细胞可以在距玻璃底部500μm的深度在整个视野中成像。注意：此步骤对于判断手术质量很重要。如果CA1受损，局灶性脑水肿会阻止距离表面超过200μm深度的荧光检测。只有当CA1没有损坏，并且CA1层的曲率被上覆的盖玻片适当地压平时，才能在手术后立即检测到DG信号（图2A-D）。代表性结果部分提供了一种确定CA1和DG之间边界的简单方法。 5. 术后护理 吸出管内的水并用塑料密封盖住，以防止碎屑进入。 保持鼠标温暖并等待从麻醉中恢复。 每24小时皮下注射美洛昔康（2mg / kg），只要小鼠表现出疼痛相关行为。 在单个外壳中举起术后小鼠数周。 6. 使用 CX3CR1-GFP 小鼠对小胶质细胞进行体内慢性双光子成像 诱导麻醉后，用无菌盐水清洗金属管内部以去除碎屑。确保通过玻璃可以看到海马体的白色肺泡（图3A），并且没有术后出血等并发症。 按照步骤4.1至4.6将鼠标置于双光子显微镜下。 检查通过海马体的双光子激发获得的图像的质量和强度（图3B）。确保术后水肿减少后拍摄的图像与手术当天拍摄的图像相当或更好（图2A，见步骤4.5）。注意：图像恶化表明大脑内存在组织损伤。 确保小胶质细胞已经恢复了其分支形态（图3C）。注意：小胶质细胞的成像数据表明，小胶质细胞至少需要3-4周才能恢复到基础状态。 出于实验的特定目的，在CA1的任何层中进行 体内 成像。