사이토네메 분석을 위한 배아 마우스 조직의 고정

이 프로토콜은 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)와 St. Jude Children ‘s Research Hospital의 승인 된 동물 관리 지침을 따릅니다. 모든 균주는 C57BL/6J 균주로 5세대를 역교차시켰다. 1. 배아 분리 및 전체 마운트 염색 6 주 된 여성을 번식시키고 질 플러그의 존재를 모니터링하십시오. 임신한 댐을 CO2챔버에서 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, AVMA 가이드라인18에 따라 자궁경부 탈구를 가한다. 해부하는 가위와 포셉을 사용하여 복강에 Y- 절개를하십시오. 승인 된 기관 지침에 따라 E9.5 배아가 포함 된 자궁을 소비하십시오. 배아를 완전한 성장 배지 (Dulbecco의 변형 이글 배지, 불필요한 아미노산, Na-pyruvate, L- 글루타민 및 10 % 태아 소 혈청으로 보충)에서 해부하십시오. 포셉을 사용하여 노른자 주머니, 태반 및 주변 막을 제거하십시오.참고 : 필요한 경우 배아 유전자형을 위해 각 노른자 낭을 저장하십시오. 분리된 배아를 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 헹구어 잔류 양수 조직과 혈액을 제거합니다. 고정 장치를 준비하십시오. 파라포름알데히드(PFA)를 HBSS에 첨가하여 최종 작업 농도 4% PFA를 만듭니다.주의: PFA는 독성 화학 물질이므로 흡입이나 직접적인 피부 노출은 피해야 합니다. 고정 용액의 준비는 장갑과 실험실 코트의 적절한 개인 보호 장비가있는 흄 후드 아래에서 수행됩니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 고정제 1mL를 넣고 각 배아를 개별 웰에 넣습니다. 로커에서 부드러운 교반으로 45 분 동안 고정제로 배아를 배양하십시오.참고 : 중요 : 모든 세척 및 배양은 배아의 갑작스런 취급 또는 움직임이 고정 된 시토네임을 파괴 할 것이므로 로커 또는 원형 쉐이커에서 부드러운 교반 (최대 20 RPM)으로 수행해야합니다. 피펫을 사용하여 모든 용액을 부드럽게 제거하십시오. 고정제를 제거하고 배아를 인산완충식염수(PBS)로 3 x 30분간세척하고 0.1% 트리톤을 첨가한Mg2+ 로 세척하였다. 세척 후, 배아를 온화한 교반으로 블로킹 용액 (Ca2+ 및Mg2+, 0.1% 트리톤 및 5% 염소 혈청을 갖는 PBS)에서 인큐베이션한다. 블록 2 x 1 h. 두 번째 블로킹 인큐베이션 후, 신선한 블로킹 용액을 사용하여 배아를 한 번 빠르게 헹구십시오. 두 번째 블로킹 단계 동안, 일차 항체 용액11을 준비한다. 최적화된 농도에 대한 항체를 PBS에서Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 희석한다.참고: 멤브레인 GFP의 향상된 시각화를 위해 치킨 안티 GFP(1:250)를 사용할 수 있습니다. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰에 1차 항체 용액 1 mL를 첨가한다. 4°C에서 3일 동안 완만한 회전으로 인큐베이션한다. 1차 항체 인큐베이션에 이어서, 배아를 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 PBS 중의 로커 상에서20 RPM에서 5 x 1시간 동안 세척한다. PBS에서 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 1:1,000 희석하여 F(ab’)2 단편2차체를 사용하여 2차 항체 용액을 제조하였다.참고: F(ab’)2 단편의 사용은 샘플로의 항체 침투를 크게 향상시킵니다. 각 웰에 이차 항체 용액 1 mL를 첨가한다. 어둠 속에서 4°C에서 3일 동안 부드럽게 흔들면서 인큐베이션한다.참고 : 중요 :이 시점부터 배아가 직접 광선에 노출되는 것을 최소화하십시오. 선택 사항: 박테리아 성장을 방지하려면 2차 항체 용액에 0.2% 아지드 나트륨을 첨가하십시오. 2차 항체 용액을 제거하고 PBS 중 배아를 3 x 30분 동안Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20, 및 5% 염소 혈청으로 세척한다. 팔로이딘 또는 다른 액틴 염료로 액틴 염색을 수행하지 않는 경우, 첫 번째 세척 후, Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% 트윈-20, 및 5% 염소 혈청을 갖는 PBS에 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 3 x 30분 세척하였다.참고: 이 시점에서, 배아는 다음 날 매립 단계가 이루어질 때까지 어둠 속에서 PBS 또는 HBSS에서 4°C에서 밤새 저장될 수 있다. 그러나 배아가 즉시 묻히고 절개되는 것이 좋습니다. 2. 배아 임베딩, 단면화 및 장착 HBSS 또는 PBS에 용해된 4% w/v 저융점(LMP) 아가로스 용액을Ca2+ 및Mg2+로 준비하여 배아 당 ~3 mL의 최종 부피로 제조한다. LMP 아가로오스의 적절한 중량을 HBSS 또는 PBS에 Ca2+ 및 Mg2+ 및 LMP 아가로오스가 용해될 때까지 마이크로파로 첨가한다.참고: LMP 아가로오스가 용해되면 LMP 아가로스 용액이 응고되지 않도록 용액을 55°C로 설정된 비드 욕조, 인큐베이터 또는 수조에 보관하십시오. 배아의 매립 금형으로 12-웰 플레이트를 사용하십시오. 12-웰 플레이트를 55°C 비드 배쓰에 놓는다. 배아를 보유할 각 웰에 4% LMP 아가로스 2.5-3 mL를 첨가한다.참고: 다른 금형을 사용할 수도 있지만, 12웰 플레이트 볼륨은 절삭을 위해 나중 단계에서 아가로스 블록을 준비하는 데 최적입니다. 천공된 숟가락을 사용하여 배아를 4% LMP 아가로스 용액을 함유하는 개별 웰로 옮깁니다(그림 1A). 12웰 플레이트를 구슬 욕조에서 벤치탑으로 옮깁니다. 피펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 삽입하고 방향을 정하여 배아가 용액 내에 집중되도록하십시오. 배아가 배향되면, 플레이트를 -20°C에서 10분 동안 배치하여 블록의 빠른 응고가 가능하도록 한다.CRITICAL: 배아가 블록의 중앙에 위치하는지 확인하십시오. 바닥에 가라 앉거나 곰팡이의 가장자리에 너무 가까운 배아는 단면화하는 동안 아가로스 블록에서 빠져 나올 가능성이 큽니다. 메스를 이용하여 우물에서 아가로스 블록 전체를 제거하고 배아 주위의 직사각형 블록을 절단하여 양쪽에 ~ 0.3cm의 블록을 남깁니다. 배아의 꼬리 끝을 따라 여분의 길이를 허용하십시오. 비브라톰에 장착되면 배아를 블록의 위쪽 부분에 있는 직립 위치에 배치합니다(그림 1B). 비브라톰의 표본 홀더에 테이프 스트립을 적용하고 아가로스 블록을 테이프에 수퍼 접착제로 붙이면 블레이드가 배아의 축 방향 섹션을 전방 (두개골)에서 후부 시퀀스로 생성하도록 배아의 축 방향 섹션을 생성합니다. 비브라톰 챔버를 차가운 HBSS로 채워 샘플이 완전히 침지되었는지 확인한 다음 챔버를 얼음으로 둘러 쌉니다. 비브라톰 속도를 0.2mm/s로, 주파수를 5~7(50-70Hz)로 설정하고 절단 두께를 100μm로 설정합니다. 배아의 직렬 축 단면화를 수행하십시오.참고: 단면화에는 느린 속도를 사용하십시오. 절단 속도가 0.25mm/s 이상으로 증가하면 단면화가 배아를 찢거나 배아를 블록에서 떼어낼 수 있습니다. 단면화 시리즈 중에는 포셉을 사용하여 개별 섹션을 HBSS로 채워진 별도의 60mm 접시로 부드럽게 옮깁니다. 포셉을 사용하여 조직이 아닌 블록을 잡아 조직 손상과 사이토 네임 파괴를 피하십시오.참고: 조직 절편은 아가로스 블록 내에 남아 있어야 합니다. 조직이 블록에서 진동 챔버로 떨어지면 섹션을 들어 올려 부드럽게 옮깁니다. 조직을 움켜 쥐거나 꼬집지 마십시오. 중요: 조직 절편의 접힘 또는 갑작스런 취급은 조직 절편의 고정 된 시토네임을 파괴합니다. F-액틴 염색을 수행하지 않은 경우, 단계 2.10으로 진행한다. F-액틴 염색을 수행하기 위해, HBSS를 제거하고, 실온에서 Ca2+ 및 Mg2+, 0.1% Tween-20 및 5% 염소 혈청으로 PBS에 희석된 Actin-Red 및 DAPI 용액으로 40분 동안 절편을 인큐베이션한다. 절편을 PBS 중 3 x 20분 동안Ca2+ 및Mg2+ 및 0.1% 트윈-20으로 세척한다. 소수성 마커 펜을 사용하여 하전된 현미경 슬라이드의 가장자리 주위에 소수성 장벽을 그리고 작은 부피의 HBSS를 추가하여 영역을 채웁니다. 포셉 또는 구멍이 뚫린 스푼을 사용하여 섹션을 슬라이드로 옮깁니다.참고: 아가로스에 싸여 있지 않은 모든 조직 절편은 이송 피펫을 통해 옮길 수 있습니다. 포셉을 사용하여 과도한 아가로스 블록을 제거하십시오. 모든 섹션이 슬라이드로 옮겨지면 피펫팅과 흡수성 타월렛의 모서리를 통해 과도한 액체를 제거한 다음 슬라이드에 장착 매체 몇 방울을 추가하십시오. 경화 시 커버슬립 영역 전체를 덮을 수 있는 충분한 장착 매체를 사용하십시오. 커버슬립을 슬라이드에 부드럽게 올려 장착합니다.주: 장착 매체가 경화될 때까지 압력을 가하거나 커버슬립을 방해하지 마십시오. 3. 이미징 임의의 공초점 또는 그 이상의 해상도 현미경(11) 상에서 조직 절편의 이미징을 수행한다. 유전자형 당 최소 세 개의 배아를 분석하십시오.참고: 조직 절편의 이미지는 TCS SP8 STED 3x 공초점 현미경을 사용하여 획득한 후 LIGHTNING 디컨볼루션을 사용하여 획득했습니다.