Yapay Olarak Yetiştirilen Bakteriler Tarafından Murin Vajinal Kolonizasyon Modelleri

Tüm hayvan deneyleri, kurumsal kılavuzlara ve California San Diego Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na (UCSD, Protokol Numarası: S20057, 2020’den itibaren) ve bundan önce Washington Üniversitesi, St. Louis’de (Protokol 20110149, 2020’ye kadar) uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür. NOT: Aşağıdaki protokol, aşılama sırasında 6-11 hafta yaşları arasında geleneksel olarak yetiştirilmiş dişi C57Bl / fareleri kullanır. Lütfen satıcı bilgilerini ve daha önce atıfta bulunulan ilgili çalışmada kullanılan belirli yaş aralıklarını dikkate alın. 1. β-estradiol 17-valeratın hazırlanması ve uygulanması NOT: β-östradiol 17-valerat bir kanserojen ve deri yoluyla emilebilen bir üreme toksinidir27,28. Toz ve sıvı çözeltinin işlenmesi sırasında uygun KKD kullanın. Aynı zamanda bir su toksini29; uygun şekilde kapatılmış ve etiketlenmiş bir kaba uygun şekilde atın. Filtre, 50 mL konik tüp vakum filtre sistemi kullanarak 0,22 μm filtre ile 50 mL’ye kadar susam yağını sterilize eder. Steriliteyi korumak için sadece bir biyogüvenlik kabininde açın. Deney için gereken β-östradiol valerat çözeltisinin hacmini hesaplayın: fare başına 200 μL artı şırınga doldurma sırasında numune kaybını hesaba katmak için ekstra 2-3 mL (örneğin; 10 farelik bir deney toplamda 4 mL gerektirir). 5 mg / mL’lik bir çözelti yapmak için gereken β-östradiol valerat miktarını hesaplayın ve doğrudan 14 mL’lik yuvarlak tabanlı bir tüpte tartın. 14 mL tüpü sıkıca kapatın ve tozdaki kümeleri parçalamak için vorteks yapın (bu, β-estradiol valeratın daha hızlı çözünmesini sağlayacaktır). 14 mL tüpe steril filtrelenmiş susam yağı ekleyin, böylece β-estradiol valeratın son konsantrasyonu 5 mg / mL olur. Sıkıca kapatılmış 14 mL tüpü, katı toz tamamen çözünene kadar 37 ° C’de 30-40 dakika boyunca bir rotatör üzerine yerleştirin. Farelere enjeksiyondan önce çözeltinin homojenliğini görsel olarak onaylayın. 37 °C’de inkübasyon, susam yağının viskozitesini azaltarak enjekte edilmesini kolaylaştırır. β-estradiol valerat çözeltisini 1 mL’lik bir şırıngaya (iğnesiz) hazırlayın. Bunu kabarcıklar sokmadan yapmak için, önce çözeltinin bir kısmını çekin, ardından şırınganın ucunu susam yağında tutarken yavaşça dışarı atın. Çözeltiyi tekrar yavaşça hazırlayın, 100 μL işaretini biraz geçin. Şırınganın üzerine iğne içinde 25 G x 5/8 yerleştirin. Daha sonra, susam yağı çözeltisini iğne ucundan çıkmaya başlayana kadar yavaşça dışarı atarak iğneyi hazırlayın. Şırınga 100 μL işaretine gelene kadar çözeltiyi dışarı atın. Fare başına bir şırınga hazırlayın. β-estradiol 17-valeratı aşılamadan önce 48 saat veya 72 saatte intraperitoneal enjeksiyonla uygulayın. Her fareye, dahaönce açıklandığı gibi 5 mg / mL β-estradiol valerat çözeltisinin (0.5 mg β-estradiol valerat / fare) 100 μL’sini enjekte edin. Kalan çözeltiyi bir sonraki enjeksiyona kadar 72 saat boyunca 4 ° C’de saklayın. β-estradiol valerat çözeltisini, farelerin vajinal aşılamasından hemen önce, aşılama gününde tekrar uygulayın. Çözeltiyi 4 °C’den çıkarın ve susam yağının ısınmasına ve daha az viskoz hale gelmesine izin vermek için enjeksiyondan önce 30 dakika boyunca 37 ° C’de bir rotatöre yerleştirin. Adım 1.7’de açıklandığı gibi enjeksiyonlara devam edin. 2. İnokulum hazırlanması NOT: Bu bölüm, anaerobik olarak yetiştirilen streptomisin’e dirençli Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR24,25,31,32’den inoküla hazırlanması için genel adımları içermektedir. Bu bölümdeki tüm adımlar anaerobik bir odada yapılmalıdır. Hazırlanan NYC III et suyu, agar ve PBS dahil olmak üzere herhangi bir reaktifi, kullanımdan en az 24 saat önce dengelemek için anaerobik bir odaya döngüleyin.NOT: Burada,% 5 hidrojen gazı karışımı ile dengelenmiş bir vinil anaerobik oda kullanılmıştır. İç oksijen konsantrasyonu tipik olarak 0 ppm’de durur, ancak malzemeleri odaya çevirirken düşük seviyeli geçici artışlar (10-25 ppm) olabilir. Vajinal aşılamadan iki gün önce, Gardnerella’yı dondurulmuş bir gliserol stoğundan anaerobik odadaki bir NYC III agar plakasına yerleştirin. Gliserol stoğunu haznenin içine ve dışına taşıma sırasında donmuş halde tutmak için kuru buzla doldurulmuş küçük bir kap (boş bir pipet ucu kutusu gibi) kullanın. Vajinal aşılamadan 1 gün önce, 10 mL NYC III suyu aşılamak için plakadan 5-10 bireysel Gardnerella kolonisi kullanın. Sıvı kültürün 37 ° C’de 16 saat boyunca gece boyunca büyümesine izin verin. Kültür ortamının aşılamadan bırakılan ikinci bir 1 mL aliquot’unu ekleyin ve ortamın kirlenmemiş olduğunu doğrulamak için aşılanmış kültürün yanında inkübe edin. İnokulumu, aşağıda açıklandığı gibi sıvı kültürden hazırlayın. İnokulum preparatını anaerobik odada mümkün olduğunca yapın.1,5 mL’lik bir küvette (1:5 seyreltme) 800 μL taze ortama 200 μL kültür ekleyerek kültür optik yoğunluğunu (OD) belirleyin. Seyreltilmiş kültürün yoğunluğunu (OD) 600 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın (boş olarak yalnızca taze ortam içeren ayrı bir küvet kullanın). 16 saat kültürünün gerçek OD600’ünü elde etmek için OD okumasını 5 ile çarpın. Deney için gereken inokulum hacmini hesaplayın. Örneğin, 15 fareyi fare başına 20 μL’lik bir inokulum ile enfekte etmek için, 15 x 20 μL = 300 μL inokülum gereklidir. Gerekenden yaklaşık% 25 daha fazla inokülum hazırlayın, bu nedenle 15 fare için 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL inokülum hazırlayın. Adım 2.4.1.’de belirlenen OD 600’ü kullanarak, adım 2.4.2’de hesaplanan hacimde bir OD600 = 5.0 inokulum elde etmek için döndürülmesi ve yeniden askıya alınması gereken16 saatlik kültürün hacmini hesaplayın. Örneğin, kültürün OD600’ü 1.5 ise ve ihtiyaç duyulan inokülum hacmi 375 μL ise, döndürülecek kültürün hacmi (375 μL x 5) / 1.5 = 1250 μL’dir. Pipet, adım 2.4.3’te hesaplanan kültür hacmi. steril bir mikrosantrifüj tüpüne. 1-3 dakika boyunca 16.000 x g’da santrifüj yaparak bakterileri topaklayın. Süpernatantı çıkarın ve peleti adım 2.4.2’de hesaplanan hacimde anaerobik PBS’de yeniden askıya alın. İnokulum şimdi hesaplanan OD600 / 5.0’da olacaktır. Mümkünse, enfekte olmamış kontrol grubundaki fareler için bir araç kontrolü görevi görecek bir PBS tüpü hazırlayın. İnokulum tüpünü anaerobik odadan çıkarmadan önce, PBS’de 1:10 ila 1:10 x 106 arasında bir seri seyreltme serisi hazırlayın. Spot plaka 5, inokulumun CFU’sunu belirlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her seyreltmenin bir agar plakasına kopyalanır. Bu aşılama öncesi CFU’dur. 3. Gardnerella ile vajinal pre-lavaj ve aşılama Anaerobik odada vajinal lavaj / yıkama tüpleri hazırlayın (bu, adım 2.4’te inokülum hazırlığı ile aynı anda yapılabilir). Pipet, fare numaralarıyla etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine 70 μL steril, anaerobik PBS’dir. Fare başına bir yıkama tüpü hazırlayın. Tüpleri sıkıca kapatın ve anaerobik odadan dışarı doğru çevirin. Adım 3.1’de hazırlanan ayrı tüplerden 50 μL anaerobik PBS ile her fareye vajinal lavaj yapın. Bu vajinal lavajlar aşılama öncesi yıkamalardır ve aşağı akış ölçümleri ve tahlilleri için kullanılabilir.İkinci β-östradiol valerat enjeksiyonunun uygulanmasından sonra (adım 1.8), her fareyi bir kafesin üstüne veya ön pençeleriyle kavrayabileceği temiz ve sert bir yüzeye yerleştirin. Kuyruğun orta kısmını yavaşça tutun ve kaldırın, böylece arka kısımlar hafifçe yükseltilir ve vajinal açıklık açığa çıkar. Bir pipet ve p-200 filtre ucu kullanarak, uygun fareye karşılık gelen yıkama tüpünden 50 μL PBS çekin. Pipet ucunu yavaşça vajinal lümene ~2-3 mm yerleştirin ve 50 μL hacmini 3x-4x yavaşça içeri ve dışarı pipetleyin. Toplanan yıkama malzemesini (~ 50 μL) geldiği aynı yıkama tüpüne geri aktarın, kalan 20 μL PBS’yi hala içeren yıkama tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Aşırı mukus varsa ve uç tıkanırsa, kalan malzemeyi toplamak ve aynı yıkama tüpüne yerleştirmek için temiz bir p-200 ucu kullanın. Konsantre bakteriyel süspansiyonun 20 μL’sini veya araç kontrolünü vajinal olarak her farenin vajinasına uygulayın. Her fareyi, o fare için vajinal lavajdan hemen sonra aşılayın (yani, bir sonrakine geçmeden önce her fare için sırayla lavaj ve aşılama yapın). Bu işlemi basitleştirmek için, biri lavajlar için 50 μL’ye, diğeri aşılamalar için 20 μL’ye ayarlanmış iki p200 pipet kullanın.Fareyi adım 3.2.1’de açıklandığı gibi kısıtlayın. Bir p-200 ucu kullanarak, vajinaya 20 μL bakteriyel süspansiyon pipetin. İki farklı bakteri türü / suşu kullanan ko-aşılama deneyleri için, her bakteriyel süspansiyonun 10 μL’sini kullanın ve aşılamadan önce iki suşu karıştırmaktan kaçının.NOT: Vajinadan dışarı dökülmeyi önlemek için toplam aşılama hacmi 20 μL’yi geçmemelidir. Uygulanan hacmin vajinal introitusta hemen birikmesini önlemek için her farenin arka ucunu 10-20 s tutmaya devam edin. Ardından, fareyi yeni bir kafese/kaba veya daha önce aşılanmış kafes arkadaşlarına yerleştirin. 3.2 adımını yineleyin. ve adım 3.3. her fare için. Fareleri asla henüz aşılanmamış hayvanların bulunduğu bir kafese geri koymayın. Bu, aşılamadan önce farelerin yanlışlıkla streptomisin’e dirençli bakterilere maruz kalmasını önler. Tüm fareler aşılandıktan sonra, inokülum tüpünü anaerobik odaya geri döndürün. Adım 2.5’te açıklandığı gibi başka bir seri seyreltme hazırlayın ve plakalayın. Bu aşılama sonrası CFU’dur. Hayvanların aşılaması sırasında anaerobik odanın dışındayken inokulumun canlılığının azalıp azalmadığını belirlemek için aşılama sonrası ve aşılama öncesi plakalardan CFU’ları karşılaştırın. Adım 3.2’de toplanan vajinal lavajları plakalayın. seçici agar üzerinde (bu durumda, 1 mg / mL streptomisin). Plakaları 37 ° C’de anaerobik bir odada 1-2 gün boyunca inkübe edin ve büyümeyi inceleyin.NOT: Büyüme, mikrobiyomun endojen üyelerinin seçim belirtecine dirençli olduğunu ve bu nedenle hedef organizmanın CFU sayımını gizleyebileceğini gösterir. 4. Uygulanabilir Gardnerella kolonizasyonunu belirlemek için vajinal lavajların toplanması Vajinal kolonizasyonu analiz etmek için vajinal yıkamaları belirli zaman noktalarında toplayın. Adım 3.2’de açıklandığı gibi toplayın. Toplandıktan hemen sonra, vajinal lavajları anaerobik bir odaya çevirin. Adım 2.5’te açıklandığı gibi seçici agar üzerine seri seyreltme ve kaplama yapmak için her lavajın 10 μL’sini kullanın. CFU sayımlarını Gardnerella (veya ilgi çekici başka bir anaerob) tarafından vajinal kolonizasyonun bir ölçüsü olarak kullanın. 5. Kurban, diseksiyon ve doku homojenizasyonu Her fareden toplanan her organ için 5 mL’lik bir tüp hazırlayın (örneğin, vajina, serviks ve uterusun hepsi toplanıyorsa, fare başına üç tüp hazırlayın). Her tüpü anaerobik haznede steril anaerobik 1x PBS (veya başka bir homojenizasyon ortamı) ile doldurun. Vajinaları ve serviksleri toplamak için kullanılan tüpler için 1 mL PBS ve uterus boynuzlarını toplamak için kullanılan tüpler için 750 μL kullanın. PBS eklendikten sonra, her bir tüpü tartın (bu, toplama öncesi ağırlıktır ve hasat edilen her dokunun toplam ağırlığını belirlemek için kullanılacaktır). Anaerobik odada bir kantar yoksa, tüpleri sıkıca kapatın ve tartılacak odadan dışarı doğru çevirin, ardından tekrar içeri sikletin.NOT: Tüp hazırlama ve ağırlık toplama fedakarlıktan 1 gün önce yapılabilir, ancak tüpler buharlaşmayı önlemek için kapakları sıkıca kapatılmış olarak anaerobik odada tutulmalıdır. Adım 3.1’de açıklandığı gibi bir dizi vajinal lavaj tüpü hazırlayın. kurban keserken son lavajı toplamak. Ayrıca, kurban sırasında standart çelik diseksiyon aletlerinin durulanması ve sterilize edilmesinde kullanılmak üzere 50 mL’lik bir deiyonize (DI) su kabı ve% 70-90 etanolden oluşan ikinci bir 50 mL beher hazırlayın. PBS dolu organ toplama tüplerini anaerobik odadan dışarı çıkarın. Dokular eklenmeye hazır olana kadar tüpleri sıkıca kapalı tutun. IACUC onaylı yöntemleri kullanarak her fareyi feda edin. Son lavajı adım 3.2.2’de açıklandığı gibi gerçekleştirin. ve 3.2.3. ya kurban edilmeden hemen önce ya da hemen sonra. Diseksiyon ve doku toplamaya başlayın. Her farenin karnını ve sırtını% 70 etanol ile püskürtün. Makası bir etanol kabında sterilize edin, kurumasını bekleyin ve ardından fare abdominopelvik boşluğunu tek bir dikey kesim yapın. Cildi geri çekmek için steril forseps kullanın ve bağırsakları vücut boşluğundan ve üreme sistemini açığa çıkaracak açık alanın kenarına hafifçe itin.NOT: Bağırsakları delmemeye veya delmemeye dikkat edin, çünkü deneysel sonuçları karıştırabilecek streptomisin’e dirençli bakterileri barındırabilirler. Maksimum vajinal dokuyu toplamak için, nekropsi sırasında kasık kemiğini kırın. Steril makas kullanarak, vajinayı kesmemeye dikkat ederken kasık kemiğinin merkezini (kasık simfizi) kırpın. İki set steril forseps kullanarak, pelvisin her iki tarafını tutun ve pelvisi yanal olarak çekerek vajinanın alt kısmını altına maruz bırakın. Serviksi nazikçe kavramak için forseps kullanın (çevreleyen dokuya kıyasla daha sert bir yapı). Vajinanın arkasına gizlenmiş ve yakından bağlı olan kolonu ortaya çıkarmak için rahim ağzını yavaşça yukarı çekin. Vajinayı dış bağ dokularından serbest bırakmak için küçük makas kullanın. Vajinayı kolondan dikkatlice ayırın ve bağırsak sistemini delmekten kaçının. Tamamen serbest bırakıldığında, vajinayı introitusa makasla yaklaştırın ve fare gövdesinden serbest bırakmak için kırpın. Rahim boynuzlarını daha görünür hale getirmek için hafifçe yukarı çekerken rahim ağzı üzerinde nazik bir tutuş sağlayın. Öte yandan, uterus boynuzlarını serbest bırakmak için sağ ve sol taraftaki yumurtalıkların hemen altından kesin. Şimdi bağlantısı kesilmiş üreme sistemini vücut boşluğundan çıkarın ve steril bir Petri plakasına yerleştirin. Bir tıraş bıçağı kullanarak, uterus boynuzlarını, serviksi ve vajinayı ayırın. Her dokuyu kendi etiketli toplama tüpüne yerleştirin. Sitokinler toplanacaksa, doku ilavesinden sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Doku eklendikten sonra her tüpü tekrar tartın. Bu, koleksiyon sonrası ağırlıktır. Dokunun toplam ağırlığını elde etmek için toplama öncesi ağırlığı toplama sonrası ağırlıktan çıkarın. Toplama tüplerindeki organları homojenize etmek için elde taşınan bir homojenizatör kullanın. Gardnerella JCP8151B için, bu adımı biyogüvenlik kabininde (aerobik olarak) veya anaerobik odada gerçekleştirin.Numuneler arasında el tipi homojenizatörün yıkanması ve aseptik olarak işlenmesi için birkaç tüp seti hazırlayın. Her setin üç adet 50 mL konik tüpe sahip olduğundan emin olun: biri DI suyuyla, biri etanol ve üçüncüsü 1x PBS ile doldurulur. Her fare tedavi grubu için ayrı bir yıkama tüpü seti hazırlayın. Homojenizatörü temizlemek için, bıçakları her yıkama tüpündeki sıvıya indirin ve cihazı maksimum hıza getirin. Homojenizatörü üç tüpün her birinde yaklaşık 3 saniye tutun. Yıkama sırası DI suyu (fiziksel kalıntıları gidermek için), daha sonra etanol (sterilize etmek için) ve son olarak 1x PBS’dir (nötralize etmek için). Her durulama arasındaki fazla sıvıyı gidermek için probu bir kağıt havlu veya tek kullanımlık tezgah pedi üzerine çalkalayın. İlk durulamayı takiben, homojenizatör probunu toplama tüpünün altına indirerek dokuları homojenleştirin ve dokuyu altındaki dokuyu hapsedin. Dokuyu öğütmek için homojenizatörü açın, suya batırılmış kalırken probu yaklaşık 5 kat yukarı ve aşağı hareket ettirin. Her organı yaklaşık 15-30 s homojenize edin. Homojenizatörü kapatıp tüpten çıkardıktan sonra, doku bozulmasının tam olarak sağlanması için içeriği görsel olarak inceleyin. Bu, bazen sonda tarafından yakalanamayan serviks ve vajina için özellikle önemlidir.NOT: Rahim boynuzlarındaki fazla yağların tamamen homojenleşmemesi sorun değildir. 5.14.1.-5.14.4. adımlarını tekrarlayın, probu her numune arasında yıkayın ve sterilize edin. Her deney grubu için yeni bir yıkama tüpü setine geçin. Homojenize numuneler içeren tüpleri anaerobik odaya taşıyın. Her dokunun bakteri yükünü belirlemek için, karıştırmak için numunenin kısa nazik vorteksini uygulayın, ardından seri seyreltme için 100 μL doku homojenatını çıkarın ve CFU tayini için seçici agar üzerine kaplama yapın (ilk seyreltme 1 x 100’dır). Daha düşük bir algılama sınırı gerekiyorsa, 200-250 μL seyreltilmemiş homojenatın yayılma kaplamasını gerçekleştirin.