JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית

Published: May 25, 2022
doi:
10.3791/64032
, , , , ,
1Division of Biology and Biomedical Sciences,Washington University School of Medicine, 2Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences,University of California, 3Glycobiology Research and Training Center,UCSD, 4Department of Pediatrics,Washington University School of Medicine

Summary

הפרוטוקול מציג מודל עכברי של התיישבות נרתיקית עם חיידקי נרתיק אנושיים בתרבית אנאירובית. אנו מתמקדים ב- Gardnerella vaginalis, תוך הכללת הצעות עבור Prevotella bivia ו – Fusobacterium nucleatum. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כמדריך לחיסונים וגינליים והתאוששות בת קיימא של חיידקים אחרים שגדלו באנאירוב.

Abstract

נרתיק היונקים יכול להיות מאוכלס על ידי טקסי חיידקים רבים. מיקרוביום הנרתיק האנושי נשלט לעתים קרובות על ידי מיני לקטובצילוס , אך אחת מכל ארבע נשים חווה וגינוזיס חיידקי, שבו רמה נמוכה של לקטובצילוס מלווה בצמיחת יתר של חיידקים אנאירוביים מגוונים. מצב זה נקשר לסיבוכים בריאותיים רבים, כולל סיכונים לבריאות הרבייה והמין. בעוד שישנן עדויות הולכות וגדלות המראות את האופי המורכב של אינטראקציות מיקרוביאליות בבריאות הנרתיק האנושי, התפקידים האישיים של חיידקים אנאירוביים שונים אלה אינם מובנים במלואם. זה מסובך בגלל היעדר מודלים מתאימים לחקר חיידקים וגינליים שגדלו אנאירובית. מודלים של עכברים מאפשרים לנו לחקור את הביולוגיה והארסיות של אורגניזמים אלה in vivo. מודלים עכבריים אחרים של חיסון חיידקי בנרתיק תוארו בעבר. במאמר זה אנו מתארים שיטות לחיסון חיידקים שגודלו באופן אנאירובי והחלמתם המעשית בעכברי C57Bl/6 שגודלו באופן קונבנציונלי. מתוארת גם שיטה פרוצדורלית חדשה, פחות מלחיצה, לחיסון נרתיקי ושטיפת הנרתיק. חיסון והתאוששות קיימא של Gardnerella מתוארים בפירוט, ואסטרטגיות עבור anaerobes נוספים כגון Prevotella bivia ו Fusobacterium nucleatum נדונים.

Introduction

אצל יונקים, הנרתיק הוא ביתם של קונסורציום של מיני חיידקים. המיקרוביום של הנרתיק האנושי ייחודי בקרב יונקים בשפע של בני הסוג לקטובצילוס וב-pH נמוך בנרתיק (3.8-4.5)1,2,3,4. הפרעה בדומיננטיות זו של לקטובצילוס נקשרת למגוון תוצאות בריאותיות שליליות.

בוגינוזיס חיידקי (BV) יש פחות לקטובצילוס ושפע מוגבר של חיידקים אנאירוביים מגוונים, כגון Gardnerella vaginalis ו- Prevotella bivia 5,6. נשים עם כ”ד נמצאות בסיכון מוגבר לזיהומים המועברים במגע מיני 7,8,9, פוריות 10, הפסדי הריון 11, לידה מוקדמת 12,13,14, זיהומים תוך רחמיים 15, זיהומים בצוואר הרחם 16 וסרטן16,17,18 . BV קשורה גם לסבירות גבוהה יותר של התיישבות נרתיקית על ידי חיידקים פתוגניים פוטנציאליים, כגון Fusobacterium nucleatum 1,19,20, מבודד נפוץ מזיהומי מי שפיר 21.

בשל חשיבותם של חיידקים אנאירוביים בבריאות הנרתיק האנושי, יש צורך במודלים של בעלי חיים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הביולוגיה והפתוגנזה של אורגניזמים אלה. במאמר זה, אנו מתארים שיטות לחיסון נרתיקי והתאוששות בת קיימא של Gardnerella vaginalis בעכברים אסטרוגניים ומציעים אסטרטגיות נוספות עבור Prevotella bivia ו – Fusobacterium nucleatum. מודלים אחרים של התיישבות נרתיקית מורין תוארו בעבר, אך אלה התמקדו בחיסון והחלמה של חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים כגון סטרפטוקוקוס22 מקבוצה B ו- Neisseria gonorrhoeae23 שגודלו בתרבית אירובית. חיסון והתאוששות של אנאירובים מחייבים ניתן להשיג בהצלחה עם אסטרטגיות ניסוי מתאימות. אנו דנים בגישות להתאוששות בת-קיימא של מספר טקסי חיידקים ומציעים הערכה אמפירית של התנאים לכדאיות של מינים/זנים נוספים בעלי עניין.

השיטה הקלאסית להערכת התיישבות על ידי חיידקים חיים היא התאוששות של יחידות יוצרות מושבה (CFU). בעכברים שגודלו באופן קונבנציונלי עם מיקרוביוטה אנדוגנית משלהם, זה דורש התאוששות על מצע אגר שבוחר נגד חברי המיקרוביוטה הנרתיקית האנדוגנית תוך מתן אפשרות לזן החיידקים המחוסן לגדול. כאן, אנו משתמשים במבודד עמיד לסטרפטומיצין של G. vaginalis24 שניתן לשחזר באופן סלקטיבי על מדיום אגר המכיל סטרפטומיצין. כדי להבטיח שהמדיום סלקטיבי מספיק, ולהפך, שחיידקים עמידים לסטרפטומיצין אינם נמצאים במיקרוביום האנדוגני, יש לצפות שטיפות נרתיקיות שנאספו ממש לפני החיסון על אגר סלקטיבי (המכיל סטרפטומיצין).

השיטה הטובה ביותר להכנת חיסונים עשויה להשתנות בין מינים וזנים של חיידקים. לפני תחילת הניסויים בעכברים, יש לבצע עבודה מקדימה כדי לקבוע תנאים מועדפים למדיום התרבית, לנקודת הקצה של הצמיחה ולהכנת החיסון, כמו גם את הרגישות לחמצן ואת הכדאיות ב- PBS. במקרה של חיידקים רגישים יותר לחמצן, ניתן לשקול תכשירים חלופיים של החיסון (למשל, במדיום תרבית אנאירובית עם קבוצת ביקורת מתאימה ברכב)25,26.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ונערכו בהתאם להנחיות המוסדיות ולמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו (UCSD, מספר פרוטוקול: S20057, 2020 ואילך) ולפני כן באוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס (פרוטוקול 20110149, עד 2020). הערה: הפרוטוקול להלן משתמש בנקבות C57Bl/ עכברים שגודלו באופן קונבנציונלי, בגיל 6-11 שבועות בזמן החיסון. שים לב למידע על הספק ולטווחי גילאים ספציפיים ששימשו בעבר בעבודה המצוטטת הרלוונטית. 1. הכנה וניהול של β-אסטרדיול 17-valerate הערה: β-אסטרדיול 17-valerate הוא מסרטן ורעל רבייה שיכול להיספג דרך העור27,28. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים במהלך הטיפול בתמיסת אבקה ונוזל. זהו גם רעלן מימי29; יש להשליך אותו כראוי במיכל אטום ומסומן כראוי. פילטר עד 50 מ”ל שמן שומשום דרך מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מערכת מסנן ואקום צינור חרוטי 50 מ”ל. פתוח רק בארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות. חשב את נפח תמיסת β-אסטרדיול ולרט הדרושה לניסוי: 200 מיקרוליטר לעכבר ועוד 2-3 מ”ל נוספים כדי להסביר אובדן דגימה במהלך מילוי מזרק (למשל, ניסוי של 10 עכברים דורש 4 מ”ל בסך הכל). חשב את כמות valerate β-אסטרדיול הדרוש לייצור תמיסה של 5 מ”ג / מ”ל ושקול אותה ישירות בצינור בעל תחתית עגולה של 14 מ”ל. מכסים את צינור ה-14 מ”ל בחוזקה ומערבולות כדי לפרק גושים באבקה (זה יאפשר ל-β-estradiol valerate להתמוסס מהר יותר). הוסף שמן שומשום מסונן סטרילי לצינור 14 מ”ל כך שהריכוז הסופי של β-אסטרדיול ואלרט הוא 5 מ”ג / מ”ל. הניחו את הצינור הסגור היטב בנפח 14 מ”ל על מסובב בטמפרטורה של 37°C למשך 30-40 דקות, עד שהאבקה המוצקה מתמוססת לחלוטין. לאשר חזותית את ההומוגניות של הפתרון לפני הזרקה לתוך העכברים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מפחיתה את צמיגות שמן השומשום, מה שהופך אותו קל יותר להזריק. צייר תמיסת β-אסטרדיול valerate לתוך מזרק 1 מ”ל (ללא מחט). כדי לעשות זאת מבלי להציג בועות, ראשית, לצייר קצת של הפתרון, ולאחר מכן לגרש בעדינות תוך שמירה על קצה המזרק בשמן שומשום. צייר את התמיסה שוב לאט, מעט מעבר לסימן 100 μL. מניחים מחט בגודל 25 גרם x 5/8 אינץ’ על המזרק. לאחר מכן, מקדמים את המחט על ידי סילוק איטי של תמיסת שמן השומשום עד שהיא מתחילה לצאת מקצה המחט. מוציאים את התמיסה עד שהמזרק מגיע לסימן 100 מיקרוליטר. הכינו מזרק אחד לכל עכבר. יש לתת את β-אסטרדיול 17-valerate על ידי הזרקה intraperitoneal ב 48 שעות או 72 שעות לפני החיסון. הזריקו לכל עכבר 100 μL של תמיסת 5 מ”ג/מ”ל β-אסטרדיול ואלרט (0.5 מ”ג β-אסטרדיול ואלרט/עכבר), כפי שתואר קודם לכן22,30. יש לאחסן את התמיסה הנותרת בטמפרטורה של 4°C למשך 72 שעות עד להזרקה הבאה. יש לתת שוב את תמיסת ה-β-estradiol valerate ביום החיסון, מיד לפני החיסון הנרתיקי של העכברים. מוציאים את התמיסה מ-4°C ומניחים אותה על מסובב ב-37°C למשך 30 דקות לפני ההזרקה כדי לאפשר לשמן השומשום להתחמם ולהיות פחות צמיג. המשך עם זריקות כמתואר בשלב 1.7. 2. הכנת חיסון הערה: סעיף זה מכיל את השלבים הכלליים להכנת חיסון מגידול אנאירובי עמיד לסטרפטומיצין Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. כל השלבים בסעיף זה צריכים להיעשות בחדר אנאירובי. יש לדחוס את כל הריאגנטים, כולל מרק NYC III, אגר ו-PBS מוכנים, לתוך תא אנאירובי כדי לאזן לפחות 24 שעות לפני השימוש.הערה: כאן, תא אנאירובי ויניל מאוזן עם תערובת גז מימן 5% שימש. ריכוז החמצן הפנימי בדרך כלל עומד על 0 ppm, אם כי יכולות להיות עליות ארעיות ברמה נמוכה (10-25 ppm) בעת מחזור חומרים לתוך התא. יומיים לפני החיסון הנרתיק, הוציאו את גרדנרלה ממלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר NYC III בתא האנאירובי. השתמש במיכל קטן (כגון קופסת קצה פיפטה ריקה) מלא בקרח יבש כדי לשמור על מלאי הגליצרול קפוא במהלך ההובלה לתוך התא ומחוצה לו. יום אחד לפני החיסון הנרתיקי, השתמש 5-10 מושבות Gardnerella בודדים מהצלחת כדי לחסן 10 מ”ל של מרק NYC III. אפשר לתרבית הנוזלית לגדול בן לילה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. יש לכלול אליציטוט נוסף של 1 מ”ל של מדיום התרבית שנותר לא מחוסן ולדגור עליו לצד התרבית המחוסנת כדי לוודא שהמדיום אינו מזוהם. הכינו את החיסון מתרבית נוזלית כמתואר להלן. בצע את הכנת החיסון בחדר האנאירובי ככל האפשר.קבע את הצפיפות האופטית של התרבית (OD) על-ידי הוספת 200 מיקרוליטר תרבית ל-800 מיקרוליטר של מדיה טרייה בקובט של 1.5 מ”ל (דילול של 1:5). השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הצפיפות (OD) של התרבית המדוללת באורך גל של 600 ננומטר (השתמש בקובט נפרד עם מדיה טרייה בלבד כריקה). הכפל את קריאת OD ב- 5 כדי לקבל את OD600 בפועל של תרבות 16 שעות. חשב את נפח החיסון הדרוש לניסוי. לדוגמה, כדי להדביק 15 עכברים עם חיסון של 20 μL לכל עכבר, 15 x 20 μL = 300 μL של חיסון נדרש. הכינו כ-25% יותר חיסונים מהנדרש, כך שעבור 15 עכברים, הכינו 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL של חיסון. באמצעות OD 600 שנקבע בשלב 2.4.1., חשב את עוצמת הקול של תרבית 16 השעות שיש לסובב כלפי מטה ולהשהות מחדש כדי לקבל חיסון OD600 = 5.0 בנפח המחושב בשלב 2.4.2. לדוגמה, אם OD600 של התרבית הוא 1.5, ונפח החיסון הדרוש הוא 375 μL, אז נפח התרבית שיש לסובב למטה הוא (375 μL x 5)/1.5 = 1250 μL. פיפטה נפח התרבות המחושב בשלב 2.4.3. לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. משחררים את החיידקים על ידי צנטריפוגה במהירות של 16,000 x גרם למשך 1-3 דקות. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב- PBS אנאירובי בנפח המחושב בשלב 2.4.2. החיסון יהיה כעת ב-OD600 מחושב של 5.0. במידת הצורך, הכינו גם צינור של PBS שישמש כבקרת רכב לעכברים בקבוצת הביקורת הלא נגועה. לפני הוצאת צינור החיסון מהחדר האנאירובי, הכינו סדרת דילול סדרתי מ-1:10 עד 1:10 x 106 ב-PBS. צלחת ספוט 5 משכפלת של כל דילול על צלחת אגר באמצעות צינור רב ערוצי כדי לקבוע את CFU של החיסון. זהו ה-CFU, טרום חיסון. 3. טרום שטיפה בנרתיק וחיסון עם גרדנרלה הכינו צינורות שטיפה / שטיפה בנרתיק בתא האנאירובי (ניתן לעשות זאת במקביל להכנת החיסון בשלב 2.4). פיפטה 70 μL של PBS סטרילי ואנאירובי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ”ל המסומנים במספרי עכבר. הכינו צינור כביסה אחד לכל עכבר. סגור היטב את הצינורות ומחזור אותם מחוץ לתא האנאירובי. בצע שטיפה נרתיקית על כל עכבר עם PBS אנאירובי 50 μL מהצינורות הבודדים שהוכנו בשלב 3.1. שטיפות נרתיקיות אלה הן שטיפות טרום החיסון וניתן להשתמש בהן למדידות ובדיקות במורד הזרם.לאחר ביצוע הזרקת ה-β-estradiol valerate השנייה (שלב 1.8), הניחו כל עכבר על גבי כלוב או משטח קשיח ונקי שהוא יכול לאחוז בכפותיו הקדמיות. אחזו בעדינות בחלק האמצעי של הזנב והרימו כך שהחלק האחורי מוגבה מעט ופתח הנרתיק חשוף. באמצעות פיפטה וקצה מסנן p-200, צייר 50 μL של PBS מצינור הכביסה המתאים לעכבר המתאים. הכנס בעדינות את קצה פיפטה לתוך לומן הנרתיק ~ 2-3 מ”מ, ופיפטה את נפח 50 μL פנימה והחוצה בעדינות, 3x-4x. העבירו את חומר הכביסה שנאסף (~ 50 μL) בחזרה לאותו צינור שטיפה שממנו הגיע, תוך צנרת מעלה ומטה בצינור הכביסה שעדיין מכיל את 20 μL הנותרים של PBS. אם יש ליחה מוגזמת והקצה נסתם, השתמשו בקצה p-200 נקי כדי לאסוף את החומר שנותר והניחו אותו באותו צינור שטיפה. יש לתת באופן וגינלי 20 μL של המתלה החיידקי המרוכז או בקרת הרכב לתוך הנרתיק של כל עכבר. יש לחסן כל עכבר מיד לאחר שטיפת הנרתיק עבור אותו עכבר (כלומר, לבצע שטיפה וחיסון ברצף עבור כל עכבר לפני המעבר לעכבר הבא). כדי לפשט תהליך זה, השתמש בשתי פיפטות p200 – אחת מוגדרת ל- 50 μL עבור שטיפות והשנייה ל- 20 μL עבור חיסונים.רסן את העכבר כמתואר בשלב 3.2.1. באמצעות קצה p-200, פיפטה 20 μL של תרחיף חיידקי לתוך הנרתיק. לניסויי חיסון משותף בשני זנים/זנים שונים של חיידקים, יש להשתמש ב-10 μL מכל תרחיף חיידקי ולהימנע מערבוב של שני הזנים לפני החיסון.הערה: נפח החיסון הכולל לא יעלה על 20 μL כדי למנוע זליגה אל מחוץ לנרתיק. המשך להחזיק את הקצה האחורי של כל עכבר במשך 10-20 שניות כדי למנוע מהנפח המנוהל להצטבר מיד באינטרואיטוס הנרתיק. לאחר מכן, הניחו את העכבר בכלוב/כלי קיבול חדש או עם חברים לכלוב שכבר חוסנו. חזור על שלב 3.2. ושלב 3.3. עבור כל עכבר. לעולם אל תחזירו עכברים לכלוב עם בעלי חיים שעדיין לא חוסנו. זה מונע חשיפה לא מכוונת של עכברים לחיידקים עמידים לסטרפטומיצין לפני החיסון. לאחר שכל העכברים חוסנו, מחזור צינור החיסון בחזרה לתוך החדר האנאירובי. הכינו וצלחו דילול סדרתי נוסף כמתואר בשלב 2.5. זהו ה-CFU שלאחר החיסון. השוו את ה-CFUs מלוחות החיסון שלאחר החיסון וטרום החיסון כדי לקבוע אם הכדאיות של החיסון ירדה מחוץ לתא האנאירובי במהלך החיסון של בעלי החיים. צלחת את שטיפות הנרתיק שנאספו בשלב 3.2. על אגר סלקטיבי (במקרה זה, 1 מ”ג / מ”ל סטרפטומיצין). לדגור את הצלחות במשך 1-2 ימים בתא אנאירובי ב 37 מעלות צלזיוס ולבחון את הצמיחה.הערה: גדילה מצביעה על כך שחברים אנדוגניים במיקרוביום עמידים לסמן הבחירה ולכן עלולים, לטשטש את ספירת CFU של אורגניזם המטרה. 4. איסוף שטיפות נרתיק לקביעת התיישבות גרדנרלה בת קיימא אסוף את שטיפות הנרתיק בנקודות זמן נבחרות כדי לנתח את נשאות הנרתיק. אסוף כמתואר בשלב 3.2. מיד לאחר האיסוף, מחזור את שטיפות הנרתיק לתוך תא אנאירובי. יש להשתמש ב-10 מיקרוליטר מכל שטיפה כדי לבצע דילול סדרתי וציפוי על אגר סלקטיבי כמתואר בשלב 2.5. השתמש בספירות CFU כמדד להתיישבות נרתיקית על ידי גרדנרלה (או אנארוב אחר של עניין). 5. הקרבה, דיסקציה והומוגניזציה של רקמות הכינו צינור של 5 מ”ל לכל איבר שנאסף מכל עכבר (לדוגמה, אם הנרתיק, צוואר הרחם והרחם נאספים כולם, הכינו שלוש צינוריות לכל עכבר). מלא כל צינור עם PBS אנאירובי סטרילי 1x (או מדיה הומוגניזציה אחרת) בתא האנאירובי. השתמש 1 מ”ל של PBS עבור צינורות המשמשים לאיסוף נרתיק וצוואר הרחם ו 750 μL עבור צינורות המשמשים לאיסוף קרני הרחם. לאחר הוספת PBS, שקול כל צינור בנפרד (זהו המשקל לפני האיסוף וישמש לקביעת המשקל הכולל של כל רקמה שנקטפה). אם סולם אינו זמין בתא האנאירובי, סגור היטב את הצינורות ומחזור אותם מחוץ לתא כדי להישקל, ולאחר מכן מחזור אותם בחזרה פנימה.הערה: הכנת צינור ואיסוף משקל ניתן לעשות יום אחד לפני ההקרבה, אבל צינורות צריך להישמר בתא אנאירובי עם כובעים אטומים היטב כדי למנוע אידוי. הכינו סט של צינורות שטיפה בנרתיק כמתואר בשלב 3.1. לאסוף את השטיפה האחרונה בעת הקרבת הקורבן. כמו כן, הכינו 50 מ”ל של מים שעברו דה-יוניזציה (DI) וכוס שנייה של 50 מ”ל של 70%-90% אתנול לשימוש לשטיפה ועיקור מכשירי דיסקציה סטנדרטיים מפלדה במהלך ההקרבה. הוציאו את צינורות איסוף האיברים המלאים ב-PBS מהחדר האנאירובי. שמור את הצינורות סגורים היטב עד שהרקמות מוכנות להוספה. הקריבו כל עכבר בשיטות שאושרו על ידי IACUC. בצע את השטיפה הסופית כמתואר בשלבים 3.2.2. ו-3.2.3. או מיד לפני ההקרבה או מיד אחריה. התחל בדיסקציה ואיסוף רקמות. רססו את הבטן והגב של כל עכבר באתנול 70%. לעקר את המספריים בכוס אתנול, לאפשר להם להתייבש, ולאחר מכן לעשות אחד אנכי לחתוך את חלל הבטן של העכבר. השתמשו במלקחיים סטריליות כדי למשוך את העור לאחור ולדחוף בעדינות את המעיים אל מחוץ לחלל הגוף לצד השדה הפתוח, מה שיחשוף את מערכת הרבייה.הערה: היזהר לא לנקב או לנקב את המעיים מכיוון שהם עלולים להכיל חיידקים עמידים לסטרפטומיצין שיכולים לבלבל את תוצאות הניסוי. כדי לאסוף את רקמת הנרתיק המקסימלית, לשבור את עצם הערווה במהלך נקרופסי. בעזרת מספריים סטריליים, חותכים את מרכז עצם הערווה (סימפיזת הערווה) תוך זהירות שלא לחתוך לנרתיק. בעזרת שני סטים של מלקחיים סטריליים, תופסים כל צד של האגן ומושכים את האגן פתוח לרוחב, תוך חשיפת החלק התחתון של הנרתיק שמתחתיו. השתמש במלקחיים כדי לאחוז בעדינות את צוואר הרחם (מבנה קשה יותר בהשוואה לרקמה שמסביב). משכו בעדינות על צוואר הרחם כדי לחשוף את המעי הגס, מוסתר מאחור ומחובר באופן הדוק לנרתיק. השתמש מספריים קטנים כדי לשחרר את הנרתיק מרקמות החיבור החיצוניות. יש להפריד בזהירות את הנרתיק מהמעי הגס ולהימנע מניקוב מערכת העיכול. כאשר הוא משוחרר במלואו, יש לאגף את הנרתיק באינטרואיטוס בעזרת מספריים ולגזור כדי לשחרר אותו מגוף העכבר. שמור על אחיזה עדינה בצוואר הרחם תוך משיכה מעט כלפי מעלה כדי להפוך את קרני הרחם גלויות יותר. עם היד השנייה, לחתוך ישירות מתחת לשחלות בצד ימין ושמאל כדי לשחרר את קרני הרחם. הסר את מערכת הרבייה המנותקת כעת מחלל הגוף והכנס אותה לצלחת פטרי סטרילית. באמצעות סכין גילוח, להפריד את קרני הרחם, צוואר הרחם, הנרתיק. הניחו כל רקמה בצינור האיסוף המסומן המתאים לה. אם ציטוקינים עומדים להיאסף, הניחו את הצינורות על קרח לאחר הוספת רקמה. לשקול כל צינור שוב לאחר הוספת הרקמה. זהו המשקל שלאחר האיסוף. הפחיתו את המשקל שלפני האיסוף מהמשקל שלאחר האיסוף כדי לקבל את המשקל הכולל של הרקמה. השתמש הומוגנייזר כף יד כדי הומוגניזציה של האיברים בצינורות האיסוף שלהם. עבור Gardnerella JCP8151B, בצע שלב זה בארון הבטיחות הביולוגית (באופן אירובי) או בתא האנאירובי.הכינו מספר סטים של צינורות לשטיפה וטיפול אספטי של הומוגנייזר כף יד בין דגימות. ודא כי כל קבוצה יש שלושה צינורות חרוטי 50 מ”ל: אחד מלא במי DI, אחד עם 70% אתנול, והשלישי עם 1x PBS. הכינו סט נפרד של צינורות שטיפה לכל קבוצת טיפול בעכבר. כדי לנקות את ההומוגנייזר, הורידו את הלהבים לתוך הנוזל בכל צינור שטיפה וסובבו את המכשיר למהירות מרבית. החזק את ההומוגנייזר בכל אחד משלושת הצינורות במשך כ -3 שניות. סדר הכביסה הוא מי DI (להסרת פסולת פיזית), לאחר מכן אתנול (לחיטוי), ולבסוף 1x PBS (לנטרול). נערו את הבדיקה על מגבת נייר או כרית ספסל חד פעמית כדי להסיר עודפי נוזלים בין כל שטיפה. לאחר השטיפה הראשונית, הומוגניזציה של הרקמות על ידי הורדת בדיקת ההומוגנייזר לתחתית צינור האיסוף, ולכידת הרקמה מתחת. הפעל את ההומוגנייזר כדי לטחון את הרקמה, להזיז בעדינות את הבדיקה למעלה ולמטה בערך 5x תוך שמירה על שקוע. הומוגניזציה של כל איבר במשך כ 15-30 שניות. לאחר כיבוי והסרת ההומוגנייזר מהצינור, בדוק חזותית את התוכן כדי להבטיח הפרעה מלאה לרקמות. זה חשוב במיוחד עבור צוואר הרחם והנרתיק, אשר לפעמים לא להיתפס על ידי בדיקה.הערה: זה בסדר אם קצת שומן עודף על קרני הרחם אינו הומוגניזציה מלאה. חזור על שלבים 5.14.1.-5.14.4., שטיפה ועיקור הבדיקה בין כל דגימה. עברו לסט חדש של צינורות שטיפה עבור כל קבוצת ניסוי. העבר את הצינורות עם דגימות הומוגניות לתוך החדר האנאירובי. כדי לקבוע את העומס החיידקי של כל רקמה, בצע מערבולות עדינות קצרות של הדגימה כדי לערבב, ולאחר מכן להסיר 100 μL של הומוגנט רקמה לדילול סדרתי וציפוי על אגר סלקטיבי לקביעת CFU (הדילול הראשון הוא 1 x 100). אם נדרש גבול נמוך יותר של זיהוי, בצע ציפוי התפשטות של 200-250 μL של הומוגנט לא מדולל.

Representative Results

ייצוג סכמטי של ניסוי לדוגמה מראה חלק מהדרכים שבהן ניתן לבצע את הפרוטוקול המתואר (איור 1). חלק מבעלי החיים יישאו חיידקים אנדוגניים במיקרוביום הנרתיק שלהם שיגדלו על מדיה לא סלקטיבית. השיטות המתוארות כאן מסתמכות על מבודדים עמידים לסטרפטומיצין של זני החיידקים הנחקרים, יחד עם מדיה סלקטיבית המכילה סטרפטומיצין, כדי לבחור נגד חיידקים אנדוגניים (איור 2A,B). עמידות לסטרפטומיצין עלולה להתפתח באופן ספונטני, ולכן בדיקת עכברים לפני ההדבקה (יום 0 לשטיפה) יכולה לעזור לקבוע אם זו עלולה להיות בעיה. התאוששות של חיידקים קיימא משטיפות בנרתיק מושגת על ידי דילול סדרתי וציפוי על מצע אגר. צלחת פטרי סטנדרטית יכולה להכיל עד 6 x 6 מערך של 5 μL כתמים, מה שמאפשר ספירה של טיטרים חיידקיים משישה כתמים משוכפלים על פני שישה סדרי גודל עבור כל דגימה אם משתמשים בדילול סדרתי פי 10 (איור 3A). השיטה הזו יכולה לשמש לספירת טיטרים של חיידקים, החל מגארדנרלה ועד פרבוטלה ופוסובקטריום (איור 3B-D). יחד, שיטות אלה מאפשרות לבחון השערות ולתת פרשנויות לגבי נשאות/זיהום חיידקי במערכת הרבייה הנשית. לדוגמה, השוואה בין טיטרים של גרדנרלה בתרחיצי נרתיק והומוגנאטים של רקמת הנרתיק הדגימה התאמה בין השיטות האלה (איור 4A). באופן דומה, במודל של חיסון משותף בנרתיק, טיטרים של Prevotella ברקמת הרחם היו גבוהים משמעותית (בערך פי 20) במהלך זיהום משותף של Gardnerella בהשוואה לזיהום מונו של Prevotella (איור 4B). לבסוף, ניתן להשוות זני חיידקים פראיים לעומת מוטנטיים במודלים אלה כדי לקבוע את התפקידים שממלאים גנים ספציפיים ותוצריהם בתהליכי התיישבות/זיהום בדרכי הרבייה. לדוגמה, זן מוטנטי של פוסובקטריום חסר יכולת להעביר ולצרוך את החומצה הסיאלית הפחמימה הוביל לרמות נמוכות יותר של נשאות עד 3 ימים לאחר החיסון (איור 4C). איור 1: סכמטי של ניסוי לדוגמה33. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: גדילה של חיידקי נרתיק מורין אנדוגניים על אגר סלקטיבי לעומת לא סלקטיבי. שטיפות נרתיק מחמש נקבות C57Bl/6 עכברים (1-5) פוזרו על שתי לוחיות אגר NYC III שונות והודגרו באופן אנאירובי. (A) הלוחית משמאל אינה מכילה אנטיביוטיקה ומאפשרת צמיחה של חיידקים אנאירוביים אנדוגניים מדרכי הנרתיק המורין. (B) הצלחת מימין מכילה סטרפטומיצין במינון 1 מ”ג/מ”ל ובוררת כנגד גדילה של חיידקים אנדוגניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: התאוששות של G. vaginalis, P. bivia ו-F. nucleatum CFUs מתרחיצי הנרתיק. (A) CFUs של G. vaginalis JCP8151B-SmR inoculum, מצופים העתק כסדרת דילול על אגר NYC III. (ב-ד) החלמה של קיימא (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25, ו- (D) F. nucleatum26 משטיפות הנרתיק של בעלי חיים נגועים מונו. עבור כל גרף (B-D), הנתונים משולבים משני ניסויים בלתי תלויים, עם 10-15 עכברים לכל ניסוי24,25,26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: ניתוח נוסף של התיישבות חיידקים אנאירובית במודל חיסון נרתיקי מוריני. (A) G. vaginalis titers בשטיפות נרתיקיות מתואמות עם G. vaginalis titers שנמצאו מהומוגנאטים ברקמת הנרתיק 24 שעות ו-72 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים בלתי תלויים, n = 10 כל אחד. מובהקות שנקבעה על פי מבחן מתאם הדרגות של ספירמן)24. (B) זיהום משותף עם G. vaginalis מוביל לעלייה בטיטרים של P. bivia ברקמת קרן הרחם בהשוואה לבעלי חיים נגועים ב- P. bivia mono infection 48 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים עצמאיים, כל אחד עם 6-10 עכברים לקבוצה. המשמעות נקבעה על ידי מבחן U-Mann-Whitney, **p = 0.0017)25. (C) F. nucleatum mutant with disrupted sialic acid transporter (Ω SiaT) הביא לירידה בטיטרים בשטיפות נרתיקיות של עכברים חד-נגועים בהשוואה ל-F. nucleatum wild-type 72 שעות לאחר החיסון (שילוב של שני ניסויים עצמאיים, כל אחד עם 10 עכברים לקבוצה. המשמעות נקבעה על ידי מבחן U-Mann-Whitney, **p < 0.01)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. קובץ משלים 1: דוגמאות לשיטות המשמשות חיידקים נרתיקיים שונים הגדלים בתנאים אנאירוביים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הדרך המשמעותית ביותר שבה שונה המודל המתואר כאן ממודלים של חיסון נרתיקי שפורסמו בעבר היא השימוש בחיידקים בתרבית אנאירובית, הדורשים שיקולים מיוחדים להכנת חיסון בר קיימא ולהתאוששות חיידקים מהעכברים. שלבים ספציפיים בפרוטוקול לעיל עשויים להשתנות מעט בהתאם למין/זן החיידקים שבהם נעשה שימוש, כפי שמוצע בקובץ משלים 1. בנוסף, כתב יד זה מתאר שיטה פרוצדורלית חדשה למתן חיידקים ושטיפות נרתיקיות, הדורשת פחות ניסיון מצד החוקר ופחות ריסון מצד העכברים. אם הנסיין אינו חש בנוח עם צורת האיפוק המתוארת בשלב 3.2. ושלב 3.3., ניתן במקום זאת לקשקש את העכברים כפי שתואר קודם לכן34 עם או בלי הרדמה בהתאם לתכנון הניסוי ולהנחיות IACUC המוסדיות.

אזהרה חשובה לשימוש בחיידקים בתרבית אנאירובית במודלים של מורין היא שצעדים מסוימים (כמו כל אלה המערבים בעלי חיים חיים) חייבים להיעשות מחוץ לתא האנאירובי. לכן, השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם אלה שבהם החיידקים המעניינים ייחשפו לסביבה אירובית, כגון במהלך חיסון העכברים. השימוש בכל אנאירוב חדש במודל זה ידרוש חקירה ראשונית של יכולתו לשמור על כדאיותו בעת חשיפה לחמצן (כגון השוואה בין CFUs לפני ואחרי החיסון כמתואר בשלב 2.5 ושלב 3.4). בהתאם למידת החמצן והרגישות PBS של האורגניזם, יש לשקול שיטות שונות להכנת חיסונים (קובץ משלים 1, שלב 2.4.5). עבור חיסונים באמצעות G. vaginalis JCP8151B, מצאנו כי ניתן להכין צינורית אחת של חיסון ב- PBS ולהשתמש בה כדי להדביק את כל העכברים. אם נעשה שימוש בחיידק אנאירובי אחר הרגיש יותר לחמצן, ניתן במקום זאת להכין את החיסון בצינורות נפרדים לכל עכבר, כך שלא יהיה צורך בפתיחה/סגירה חוזרת של הצינור. כמו כן, אם זן החיידקים המעניין הוא יותר קפדני / פחות מסוגל לשרוד PBS מאשר G. vaginalis, החיסון יכול להיות מוכן במקום זאת במדיה תרבית. אם המדיום המשמש מכיל חומרים מחזרים, כגון מדיום ה- CDC anaerobe המשמש לתרבית Prevotella bivia (קובץ משלים 1, שלב 2.1. ושלב 2.2.), אז לחיידקים תהיה גם הגנה מוגברת מפני חשיפה לחמצן.

ניתן לשקול גם שיטות חלופיות להומוגניזציה, כגון מכות חרוזים22,35, אשר נעשה עם מכסה הצינור סגור ועשוי, לכן, להכניס פחות חמצן מאשר הומוגנייזר כף יד. בנוסף, אורגניזמים רגישים יותר לחמצן עשויים לדרוש זמן שיווי משקל ארוך יותר עבור מדיה. מחוון חמצן כגון resazurin יכול לשמש כדי לבדוק כי תנאים אנאירוביים הגיעו (שלב 2.1). שיטות חלופיות כגון צנצנות אנאירוביות עשויות להשפיע על התוצאות ויש לבדוק את כדאיות החיידקים לפני השימוש.

הרגישות לחמצן והקפדנות של אורגניזם הניסוי עשויות גם לשחק תפקיד בהתאוששות מוצלחת של חיידקים בני קיימא מהעכבר במהלך שטיפה/הומוגניזציה (קובץ משלים 1, שלב 3.2 ושלב 5.1). עבור אורגניזמים רגישים מאוד, הזמן בין לקיחת השטיפה לבין הציפוי עלול להוביל לאובדן הכדאיות ולגרום לאומדן נמוך באופן מלאכותי של התיישבות חיידקים בנרתיק. כדי למתן השפעה זו, ניתן לדלל מיד שטיפות שנאספו למדיה תרבית אנאירובית טרייה (עם חומר מפחית). באופן דומה, הומוגניזציה של איברים יכולה להיעשות במדיה תרבית טרייה ולא PBS כדי להגביר את הכדאיות החיידקית, וניתן לעשות זאת גם בתא האנאירובי עצמו כדי למזער את החשיפה לחמצן.

בהתאם למטרה של ניסוי נתון, הנסיין חייב לשים לב לקבוצות ביקורת. כדי לבחון השערות, מדדים בסיסיים של עכברי ביקורת לא נגועים שמטופלים בדחיקה ברכב בלבד יסייעו לקבוע אם יש אינדוקציה של כימוקינים/ציטוקינים או תוצאות ספציפיות אחרות של זיהום. רכב הבקרה המשמש חייב להיות זהה לרכב המשמש לחיסון, כך שאם החיידקים מחוסנים באמצעי תרבית, אזי יש להשתמש באמצעי תרבית לא מחוסנים כבקרה (קובץ משלים 1, שלב 2.4.5).

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות גם על חיידקים פקולטטיביים המסוגלים לגדול באופן אנאירובי אך נחקרים באופן מסורתי באמצעות תנאי תרבית אירובית (כגון Escherichia coli או סטרפטוקוקוס מקבוצה B). זה יכול להיות רלוונטי במיוחד עבור זיהומים על ידי אורגניזמים אלה באתרי הגוף כי הם האמינו להכיל רמות נמוכות של חמצן, כגון צוואר הרחם. ייתכן שאורגניזם פקולטטיבי מדביק בהצלחה רבה יותר אתרים עם פחות חמצן כאשר החיסון מוכן באופן אנאירובי בהשוואה לאירובי. בניסוי כזה, התאוששות של חיידקים קיימא לספירת CFU עשויה שלא לדרוש תנאים אנאירוביים.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ללין פוסטר על הסיוע הטכני במהלך הפיתוח של מודלים אלה. אנו מעריכים קרנות סטארט-אפ מהמחלקה למיקרוביולוגיה מולקולרית ומהמרכז לחקר מחלות זיהומיות לנשים (ל-AL), ואת March of Dimes (פרס בזיל אוקונור ל-AL) שעזרו לתמוך בניסויים בשלבים מוקדמים. המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (R01 AI114635) תמך גם הוא בפיתוח מודלים אלה.

Materials

β-estradiol 17-valerate Sigma E1631 estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter Fisher  SCGP00525 sterile filtering sesame oil
14 mL tube Falcon 352059 estrogenization of mice
190-proof ethanol Koptec  V1105M dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS Fisher MT21040CM vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle BD 305122 estrogenization of mice
5 mL tube Falcon 352063 Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber Coy 7200000 Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar Fisher DF0140074 G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone Fisher DF0118170 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth Fisher DF0944170 Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood Hemostat DSB500 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps Fine Science Tools  11008-13 mouse/tissue dissection
Glucose Sigma G7528 NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer ISC Bio 3305500 Tissue homogenization
Hemin Sigma 51280 CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES Cellgro 25-060-Cl NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum Hemostat SHS500 NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) Matheson Gas for anaerobic chamber
Isofluorane VetOne 502017 mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine Sigma C1276 CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate Sigma G1626 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 for making media and homogenization
NaCl Sigma S3014 NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets Sigma S5881 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas  Airgas  Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips ISC Bio  P-1237-200 vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein Sigma 70169 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3 Fisher DF-122-17-4 NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors Fine Science Tools  14084-08 mouse/tissue dissection
Sesame oil Fisher  ICN15662191 estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades VWR 55411-050 tissue dissection
Sodium chloride Sigma S3014 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
Streptomycin Gibco 11860038 add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe BD 309659 estrogenization of mice
Vitaim K3 Sigma M5625 Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1 Sigma 95271 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract Fisher DF0127-17-9 NYCIII media for G. vaginalis growth
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, 273-281 (1993).
  2. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
  3. Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. Bacteriology of the vagina. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).
  4. van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
  5. Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
  6. Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
  7. Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
  8. Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
  9. Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
  10. Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
  11. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  12. Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
  13. DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
  14. Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
  15. Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
  16. Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
  17. Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
  18. Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
  19. Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
  20. Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
  21. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).
  22. Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
  23. Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
  24. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  25. Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
  26. Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
  27. Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
  28. Yager, J. D., Davidson, N. E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).
  29. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
  32. Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
  33. Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022)
  34. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  35. Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).

Tags

Anaerobic BacteriaVaginal ColonizationMurine ModelInoculationVaginal LavageColony-forming UnitsObligate AnaerobesFastidious BacteriaSpectrophotometryAnaerobic Conditions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha, S., Lewis, W. G., Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (183), e64032, doi:10.3791/64032 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image