Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma ^1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni ^3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità⁶.

Esistono diversi metodi disponibili per generare più di una trappola ottica. Questi includono specchi a scansione galvanometrica, modulatori ottici acustici e ottiche diffrattive, che generano pinzette ottiche olografiche 4,7,8,9. Spesso, specchi a scansione e modulatori ottici acustici producono trappole che multiproprietà. Nella configurazione qui descritta, il fascio di un singolo laser Nd: YAG viene diviso sulla polarizzazione, e quindi gli specchi di scansione laser galvanometrici controllano la posizione di quella che viene definita la trappola mobile (Figura 1) ⁴. Per facilitare il posizionamento di specchi e filtri per dirigere il fascio di intrappolamento verso l’apertura posteriore dell’obiettivo del microscopio, viene utilizzato un laser HeNe. Ciò rende più facile l’allineamento generale in quanto il fascio HeNe è visibile ad occhio nudo, mentre i raggi infrarossi non lo sono. Il fascio HeNe è anche più sicuro da lavorare rendendo il posizionamento di specchi e altri componenti meno stressante. Inizialmente, il percorso del fascio per questo laser è separato dal raggio di 1064 nm, ma viene introdotto nello stesso percorso del fascio e quindi nell’obiettivo del microscopio. Una volta raggiunto l’allineamento fisico, viene eseguito il posizionamento del fascio di 1064 nm sopra il fascio HeNe e questo è facilitato dall’uso di un visualizzatore a infrarossi e vari strumenti di imaging del fascio per visualizzare la posizione e la qualità del fascio. Quindi, viene introdotto l’espansore del fascio e il raggio infrarosso espanso risultante viene allineato sull’apertura posteriore dell’obiettivo. Infine, l’obiettivo viene rimosso e la potenza in ciascun fascio polarizzato viene misurata e regolata utilizzando piastre d’onda λ/2 per essere uguale (Figura 1C). Le misurazioni della potenza vengono eseguite anche una volta restituito l’obiettivo e in genere c’è una perdita di potenza del 53%. C’è, tuttavia, una potenza sufficiente per formare trappole ottiche fisse e mobili stabili nel piano focale (Figura 1D).

Per visualizzare le transazioni del DNA, le celle a flusso microfluidico svolgono un ruolo chiave in quanto consentono misurazioni controllate a livello di singola molecola con un’elevata risoluzione spaziale e temporale (Figura 2). Il termine microfluidica si riferisce alla capacità di manipolare fluidi in uno o più canali con dimensioni comprese tra 5-500 μm^10,11. Il termine flusso si riferisce al fluido effettivo all’interno di un canale e il canale si riferisce al canale fisico in cui si muovono uno o più flussi di fluidi. Il design della cella di flusso a canale singolo ha un canale fisico comune in cui vengono osservate le reazioni e in genere è presente un solo flusso di fluido. Pertanto, questi progetti sono noti come celle di flusso a flusso singolo. Al contrario, le celle a flusso multi-stream sono definite come un dispositivo microfluidico in cui due o più canali di ingresso convergono in un singolo canale fisico comune (Figura 2A). All’interno del canale comune, i flussi fluidi che hanno origine dai singoli canali fluiscono paralleli l’uno all’altro e rimangono separati con una miscelazione minima tra loro che si verifica a causa della diffusione (Figura 2B). Nella maggior parte delle configurazioni sperimentali, una singola pompa spinge i fluidi in ciascun canale alla stessa velocità. Al contrario, quando viene utilizzato lo sterzo di confine, tre o più pompe a controllo indipendente spingono i fluidi attraverso i canali. Tuttavia, ogni pompa funziona a una velocità diversa, ma la portata netta nel canale comune è costante¹². Ciò consente la rapida sostituzione dei componenti del canale principale semplicemente modificando la velocità della pompa.

Oltre al flusso laminare, un altro fattore critico è il profilo di velocità parabolica all’interno del flusso di fluido laminare. La velocità di flusso più elevata si verifica nel mezzo del flusso e la più lenta si verifica vicino alle superfici (Figura 2C)¹³. Questo profilo deve essere considerato per allungare completamente una molecola di DNA che è attaccata a una perla tenuta nel flusso per una visualizzazione precisa del DNA fluorescente e accurate analisi di singole molecole. Qui, il DNA è allungato in forma B e viene tenuto in posizione sotto 0 pN di forza. Per raggiungere questo obiettivo, la messa a fuoco della posizione della trappola ottica dovrebbe essere in una posizione di 10-20 μm dalla superficie inferiore del coperchio (Figura 2D). Bisogna fare attenzione in modo che la molecola di DNA non sia allungata oltre la forma B in quanto ciò può inibire le reazioni enzimatiche. In condizioni tampone tipiche, 1 μm = 3.000 bp di DNA¹⁴. Inoltre, intrappolando 10-20 μm dal vetrino, il complesso del DNA viene posizionato lontano dalla superficie, riducendo così al minimo le interazioni superficiali.

Molti metodi sono stati utilizzati per creare canali di dispositivi microfluidici e questi possono essere fatti in laboratorio o celle di flusso possono essere acquistati da fonti commerciali 6,15,16,17. I materiali ottimali utilizzati per costruire le celle di flusso devono essere meccanicamente rigidi, otticamente trasparenti con bassa fluorescenza e impermeabili ai solventi organici⁶. Spesso, il vetro float borosilicato o la silice fusa vengono utilizzati per fornire un ambiente di flusso stabile per un tempo prolungato adatto per l’intrappolamento ottico, la visualizzazione e il rilevamento della forza. Questi materiali consentono anche l’uso di solventi non acquosi (ad esempio, metanolo spettrofotometrico) per semplificare la bagnatura superficiale e la rimozione delle bolle d’aria e denaturanti (ad esempio, 6M guanidinium cloridrato) o detergenti per pulire la cella di flusso. Infine, i metodi utilizzati per introdurre fluidi nelle celle di flusso variano da complessi sistemi di pompe per vuoto a pompe a siringa singola 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Nell’approccio qui descritto, viene utilizzata una pompa a siringa che può contenere fino a 10 siringhe (Figura 3A). Ciò offre la flessibilità di utilizzare celle di flusso a canale singolo o celle di flusso con più canali di ingresso. Qui, viene utilizzata una cella di flusso a tre canali che viene accoppiata a siringhe tenute in posizione sulla pompa a siringa utilizzando tubi in poli-etere-etere-chetone (PEEK) (Figura 3A-C). Il flusso dei fluidi è controllato da valvole di commutazione a quattro vie e serve quindi a ridurre al minimo l’introduzione di bolle nella cella di flusso (Figura 3A,D). Inoltre, si raccomandano siringhe a tenuta di gas Hamilton con pareti di vetro rigide e stantuffi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE), in quanto forniscono un movimento eccezionalmente regolare dello stantuffo che è essenziale per ottenere un flusso regolare^14,27.

Nel sistema sperimentale descritto sono state utilizzate celle di flusso con canali di ingresso da due a cinque. Il numero di canali di ingresso è dettato dall’esperimento in corso. Per lo studio di RecBCD e Hop2-Mnd1, due canali di flusso erano sufficienti^14,28. Per l’elicasi, l’enzima è stato legato all’estremità libera del DNA e tradotto in un flusso contenente magnesio e ATP per avviare la traslocazione e lo svolgimento. Per Hop2-Mnd1, il DNA intrappolato otticamente è stato tradotto nel flusso fluido adiacente contenente proteine e tampone ± ioni metallici bivalenti. L’uso di cellule a flusso a tre canali consente di intrappolare il DNA nel flusso 1, tradurre il DNA nel flusso 2 per consentire il legame proteico e quindi di flusso 3 dove è presente ATP, ad esempio, per avviare reazioni. Una variazione di quanto sopra è quella di utilizzare proteine marcate con fluorescenza nel canale 2, che si traduce in un flusso fluido completamente bianco e preclude la visualizzazione del DNA. Quando questa molecola viene tradotta nel flusso 3, sia le proteine che il DNA sono ora visibili quando vengono avviate le reazioni.

L’uso di valvole di commutazione a quattro vie per controllare il flusso del fluido è un componente critico del sistema per eliminare le bolle nelle celle di flusso. Le bolle sono dannose per il flusso stabile del fluido in quanto si contraggono e si espandono in modi imprevedibili con conseguenti rapidi cambiamenti nella velocità del flusso e l’introduzione di turbolenza. Quando le valvole sono posizionate tra siringhe e tubi di ingresso, il percorso del flusso viene scollegato cambiando la posizione della valvola quando le siringhe vengono sostituite. Quando la nuova siringa viene posizionata, lo stantuffo può essere premuto manualmente in modo che vengano espulsi >6 μL (il volume morto della valvola) e questo elimina quasi completamente le bolle.

Il collegamento di connettori alle celle di flusso è spesso la fase limitante nell’uso delle celle di flusso. Descriviamo l’uso di due tipi di connettori: rimovibili noti come press-fit e permanenti (assemblaggi nanoport). I connettori rimovibili sono semplici da aderire a una cella di flusso e diversi tipi di tubi flessibili oltre al PTFE consigliato possono essere testati con questi connettori. Questo è un modo rapido ed economico per testare tubi e connettori senza sacrificare celle di flusso in vetro più costose. Al contrario, i gruppi nanoport sono fissati in modo permanente, resistono a pressioni fino a 1.000 psi, e, nelle nostre mani, il loro uso è limitato a tubi in PEEK di diversi diametri. Questo non è uno svantaggio in quanto viene preferibilmente utilizzato il tubo PEEK. Una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti collegati può essere riutilizzata per più di 1 anno con un uso attento.