FACS-aislamiento y cultivo de progenitores fibroadipogénicos y células madre musculares a partir de músculo esquelético de ratón imperturbable y lesionado
Summary
La identificación precisa de las células progenitoras fibroadipogénicas (FAP) y las células madre musculares (MuSC) es fundamental para estudiar su función biológica en condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo proporciona pautas para el aislamiento, purificación y cultivo de FAP y MuSC de músculos de ratones adultos.
Abstract
Las células progenitoras fibro-adipogénicas (FAP) son una población de células estromales mesenquimales residentes en el músculo esquelético (MSC) capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico. Junto con las células madre musculares (MuSC), las FAP desempeñan un papel crítico en la homeostasis, reparación y regeneración muscular, al tiempo que mantienen y remodelan activamente la matriz extracelular (ECM). En condiciones patológicas, como daño crónico y distrofias musculares, los FAP experimentan una activación aberrante y se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a fibrosis e infiltración grasa intramuscular. Por lo tanto, los FAP desempeñan un doble papel en la regeneración muscular, ya sea manteniendo el recambio de MuSC y promoviendo la reparación de tejidos o contribuyendo a la formación de cicatrices fibróticas e infiltrados de grasa ectópica, que comprometen la integridad y la función del tejido muscular esquelético. Una purificación adecuada de FAPs y MuSCs es un requisito previo para comprender el papel biológico de estas células en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, describimos un método estandarizado para el aislamiento simultáneo de FAP y MuSC de los músculos de las extremidades de ratones adultos utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El protocolo describe en detalle la disociación mecánica y enzimática de células mononucleadas de músculos de extremidades enteras y músculos tibiales anteriores lesionados (TA). Los FAP y MuSC se aíslan posteriormente utilizando un clasificador celular semiautomático para obtener poblaciones celulares puras. Además, describimos un método optimizado para cultivar FAPs y MuSCs quiescentes y activados, ya sea solos o en condiciones de cocultivo.
Introduction
El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo, representa ~ 40% del peso humano adulto, y es responsable de mantener la postura, generar movimiento, regular el metabolismo energético basal y la temperatura corporal1. El músculo esquelético es un tejido altamente dinámico y posee una notable capacidad para adaptarse a una variedad de estímulos, como el estrés mecánico, las alteraciones metabólicas y los factores ambientales diarios. Además, el músculo esquelético se regenera en respuesta a una lesión aguda, lo que lleva a la restauración completa de su morfología y funciones2. La plasticidad del músculo esquelético se basa principalmente en una población de células madre musculares residentes (MuSC), también denominadas células satélite, que se encuentran entre la membrana plasmática de miofibras y la lámina basal 2,3. En condiciones normales, los MuSC residen en el nicho muscular en estado quiescente, con sólo unas pocas divisiones para compensar la renovación celular y para reponer el conjunto de células madre4. En respuesta a la lesión, los MuSCs entran en el ciclo celular, proliferan y contribuyen a la formación de nuevas fibras musculares o regresan al nicho en un proceso de auto-renovación 2,3. Además de los MuSCs, el mantenimiento homeostático y la regeneración del músculo esquelético dependen del apoyo de una población de células musculares residentes denominadas progenitores fibroadipogénicos (PAF)5,6,7. Los FAP son células estromales mesenquimales incrustadas en el tejido conectivo muscular y capaces de diferenciarse a lo largo del linaje fibrogénico, adipogénico, osteogénico o condrogénico 5,8,9,10. Los FAP proporcionan soporte estructural para los MuSC, ya que son una fuente de proteínas de la matriz extracelular en el nicho de las células madre musculares. Las PAF también promueven el mantenimiento a largo plazo del músculo esquelético mediante la secreción de citoquinas y factores de crecimiento que proporcionan apoyo trófico para la miogénesis y el crecimiento muscular 6,11. Tras la lesión muscular aguda, los FAPs proliferan rápidamente para producir un nicho transitorio que apoya la integridad estructural del músculo regenerador y proporciona un ambiente favorable para sostener la proliferación y diferenciación de MuSCs de manera paracrina5. A medida que avanza la regeneración, los FAP se eliminan del músculo regenerativo por apoptosis, y su número regresa gradualmente al nivel basal12. Sin embargo, en condiciones que favorecen la lesión muscular crónica, los FAP anulan la señalización proapoptótica y se acumulan en el nicho muscular, donde se diferencian en fibroblastos y adipocitos productores de colágeno, lo que lleva a infiltrados de grasa ectópica y formación de cicatrices fibróticas12,13.
Debido a su multipotencia y sus capacidades regenerativas, los FAP y MuSC han sido identificados como objetivos prospectivos en medicina regenerativa para el tratamiento de trastornos del músculo esquelético. Por lo tanto, para investigar su función y potencial terapéutico, es importante establecer protocolos eficientes y reproducibles para el aislamiento y cultivo de FAPs y MuSCs.
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede identificar diferentes poblaciones celulares en función de características morfológicas como el tamaño y la granularidad, y permite el aislamiento específico de células basado en el uso de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular. En ratones adultos, los MuSC expresan la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1, también conocida como CD106)14,15 y α7-Integrina 15, mientras que los FAP expresan el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas α (PDGFRα) y el antígeno de células madre 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . En el protocolo descrito aquí, los MuSC se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mientras que los FAP se identificaron como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, se emplearon ratones PDGFRαEGFP para aislar FAPs como eventos CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. Además, comparamos la superposición entre la señal fluorescente de las células PDGFRα-GFP+ con las células identificadas por el marcador de superficie Sca1. Nuestro análisis mostró que todas las células que expresan GFP también fueron positivas para Sca1, lo que indica que cualquiera de los enfoques puede emplearse para la identificación y aislamiento de FAPs. Finalmente, la tinción con anticuerpos marcadores específicos confirmó la pureza de cada población celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El establecimiento de protocolos eficientes y reproducibles para la identificación y el aislamiento de poblaciones de células madre adultas puras es el primer y más crítico paso hacia la comprensión de su función. Los FAP y MuSC aislados se pueden usar para realizar análisis multiómicos en experimentos de trasplante como un tratamiento potencial para enfermedades musculares o pueden modificarse genéticamente para modelar enfermedades en la terapia con células madre.
El protocolo des…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Tom Cheung (Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong) por su asesoramiento sobre el aislamiento de MuSC. Este trabajo fue financiado por el NIAMS-IRP a través de las subvenciones de los NIH AR041126 y AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
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