微小管タクトイドの自己組織化

注:特に明記されていない限り、実験の一部は、適切な保護具(手袋)を着用したまま、ラボベンチで行うことができます。 1. カバースリップシラナイゼーション メモ:カバースリップは、これらの実験で使用したポリマーブラシコーティングで使用するためにシラン化する必要があります。これは、疎水性中央ブロックを有するブロックコポリマーが結合してポリマーブラシを作成することを可能にする疎水性シラン化処理である。次の手順は、手袋を着用している間に有毒な蒸気にさらされるのを防ぐために、ヒュームフードで実行する必要があります。ジメチルジクロロルシランは非常に毒性が高く、細心の注意を払って取り扱わなければなりません。 カバースリップをddH2O、70%エタノール、ddH2Oで順番にすすいでください。各すすぎの間に糸くずのない実験室用ワイプでそれらを乾燥させます。これは、処理前に表面からほこりや水溶性または有機粒子を除去する。 カバースリップを金属製のカバースリップ保持ラックに置き、ラックを UV-Ozone (UVO) マシンに移します。カバースリップにUVOを20分間照射し、バックグラウンド蛍光を除去します。UVOの代わりにプラズマチャンバを使用することができます。 ピンセットを使用して、カバースリップをUVO処理に使用する金属ラックからシラン処理に使用する別の金属ラックに移します。UVOを適用すると高レベルの酸化を引き起こすため、両方に同じラックを使用しないでください。ラックを水とエタノールで事前に清掃して、以前の使用による残留化学物質が残らないようにします。 カバースリップの入ったラックを、アセトン 100% の入った容器に 1 時間浸します。容器を水道水で3xすすぎ、次にddH2Oで3xですすぎ、アセトンをすべて除去します。 カバースリップの入ったラックを 100% エタノールに 10 分間浸します。容器を水道水で3xすすぎ、次にddH2Oで3xすすぎ、すべてのエタノールを除去します。 カバースリップ 3x でラックを ddH2O に 5 分間浸します。 カバースリップでラックを 0.1 M KOH (1 M KOH 50 mL と ddH2O 450 mL) に 15 分間浸します。容器を水道水で3xすすぎ、次にddH2Oで3xすすぎ、すべてのKOHを除去します。 カバースリップ 3x でラックを ddH2O に 5 分間浸します。 カバースリップでラックをヒュームフードまたは層流フードで一晩空気乾燥させます。 ラックとカバースリップを完全に乾燥させた後、シラン専用の別の容器に入れた2%ジメチルジクロロシラン(DDS)に5分間浸漬します。乾燥していないものをシランに接触させないでください。 ラックとカバースリップを100%エタノールの入った容器に2倍に5分間浸します。容器を水道水で3xすすぎ、次にddH2Oで3xすすいでください。 ラックとカバースリップを ddH 2 O に3xずつ 5 分間浸します。 カバースリップでラックをヒュームフードまたは層流フードで一晩空気乾燥させます。 この最後の乾燥ステップの後、ピンセットを使用してカバースリップをカバースリップボックスに戻します。これらのカバースリップは、今後1〜2ヶ月で使用できます。古いカバースリップはコーティングを失い始め、廃棄する必要があります。 2. チューブリン製剤 注:購入したチューブリンは、標識されていないか、蛍光色素で標識された凍結乾燥粉末として提供されます。凍結乾燥チューブリンは−80°Cの冷凍庫に貯蔵される。次の手順は、標識されていないチューブリンと標識されたチューブリンを可視化に適した比率で混合するために使用されます。 凍結乾燥チューブリン粉末1mgを含む標識されていないチューブリンのアリコートを−80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上に保管する。チューブに200 μLの冷たいPEM-80を加え、チューブリン濃度を5 mg/mLにします。すべての凍結乾燥物を溶解するために10分間氷の上に保管してください。 凍結乾燥チューブリン粉末20μgを含むローダミン標識チューブリンのアリコート1個を−80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上に保管する。チューブに4 μLの冷たいPEM-80を加え、チューブリン濃度を5 mg/mLにします。凍結乾燥剤を完全に溶解するために10分間氷の上に保管してください。 溶解したら、100 μLの非標識再懸濁チューブリン溶液をローダミン標識チューブリンの4 μL溶液に加える。ピペット6x-7xを非常にゆっくりと混合します。凝集体が見える場合は、可溶化チューブリンを90,000 x g で10分間遠心分離し、ペレットを捨てて上清を保持することによって凝集体を除去します。このチューブリン混合は、〜4%の標識チューブリンをもたらすであろう。 残りの100 μLの非標識チューブリンを液体窒素(LN2)にドロップフリーズし、追加のチューブリン混合物に使用するために−80°Cで保存します。 標識されたチューブリンミックスとアリコートを、それぞれ15μLの7本のチューブに入れます。各アリコートは、単一の実験チャンバーに使用することができる。残りのアリコートをドロップフリーズし、将来の実験のために−80°Cで保存する。 3. MAP65 精製 注:MAP65は市販されていないため、この作業のために精製する必要があります。このプロトコルは、以前にいくつかの出版物23,29で詳述されている。 MAP65プラスミドおよびGFP-MAP65プラスミドをBL21細菌株に形質転換し、タンパク質発現を行う。 BL21細菌を600nmで0.6-1の光学密度まで増殖させる。lacオペレータを使用してタンパク質生産を誘導し、細菌を一晩増殖させる。 培養物をペレット化し、細菌を溶解する。 遠心分離後に溶解液を収集し、6x-ヒスチジンタグを結合するために利用可能なニッケルイオンを有するビーズでインキュベートする。 イミダゾールを使用してタンパク質を溶出し、それを脱塩します。 タンパク質を液体窒素でドロップフリーズし、1年以内に使用するために−80°Cで保存してください。 4. フローチャンバの組み立て 注:実験は、スライドガラスとシラン処理カバーガラスで作られたフローチャンバで行われます(図3)。 スライドガラスを取り、ddH2O、エタノール、ddH2Oを順番に使って掃除します。各すすぎの間に糸くずの出ない実験室用ワイプで乾燥させます。 両面テープを使用して流路を作成します。手袋をはめた手を使って、テープを約25〜30mmの長さにカットします。テープを縦に分割して、2 つの薄いストリップを作成します。2 つのテープ ストリップをスライドの上に置き、その間に約 5 ~ 8 mm を置きます。メモ:テープの厚さは約80〜100μmに標準化されているため、テープ片間のパスの幅によってチャンバ内の体積が決まります。 シラン処理されたカバースリップを流路の上に置きます。スライドとカバースリップを両面テープストリップに密封するには、ペンの背面でテープ領域を軽く押します。エリア全体で良いシールをしてください。シールがうまく作られると、テープは半透明から透明に変わるはずです。 縁の余分なテープを取り外し、カミソリの刃でテープを切断して、フローチャンバの入り口からわずか1mmを残します。 必要に応じて、実験パラメータに関する情報をチャンバーにラベル付けします。 5. タクトイド実験 注:すべての試薬と供給が生成されると、フローチャンバ内の微小管タクトイドを核形成および重合するために使用できます。 使用する試薬をすべて集めます。氷の上でそれらを解凍し、作業中に氷の上にそれらを保存します。実験のためにいくつかのフローチャンバを作ります。 実験ごとに1つのフローチャンバを使用します。PEM-80に溶解した5%非イオン性ブロック共重合体界面活性剤(材料表)を20μLで流すことによって、チャンバの両端に小さな滴を流してフローチャンバ表面をポリマーブラシでコーティングし、内部の気泡の形成を防止します。使用する準備ができるまで(少なくとも5〜7分)、湿気の多いチャンバー(すなわち、濡れた糸くずのない実験室用ワイプ付きのペトリ皿)に保管してください。 滅菌チューブ中で、以下を混合してTubulin-MAPミックスを作成する:9.5μLのPEM-80;4 μL の 10 mM GMPCPP;4μLの5%プルロニック-F127;1 μL の 1M DTT;1μLのグルコース;2μLのポリエチレングリコール(PEG);ステップ2.5からの12 μLの5 mg/mLチューブリンミックス(13.6 μM最終濃度)。MAP65の5.5μLの作業ストック(10%は視覚化のためのGFP-MAP65)です。混合しながら氷の上を保ちます。注:粘性PEG溶液の取り扱いには、正の変位ピペットを使用することをお勧めします。通常のピペットは、開口部を大きくするために先端を切断した後に使用することができます。ただし、この方法は精度が低くなります。 ピペッティングで5x-6xを混ぜる。 チャンバーに添加する直前に、グルコースオキシダーゼ(0.5 mg/mL)とカタラーゼ(0.15 mg/mL)(デオキシ)の予備混合溶液1 μLをTubulin-MAPミックスに加え、7x-8xを混合します。溶液の全容量(40 μL)を2つの部分に分割し、別々のチャンバーで使用します。 チューブリン-MAPミックスをチャンバーに流します。チャンバーにはすでに非イオン性ブロック共重合界面活性剤が含まれているため、古い液体を取り除かずにより多くの液体を追加することはできません。これを行うには、チャンバーのもう一方の端にあるろ紙または糸くずの出ない実験室用ワイプを使用して、毛細管現象によって液体を除去します。 サンプルがチャンバ内に完全に収まったら、5分間エポキシを使用してチャンバの両端を密閉し、37°Cで約30分間保持して微小管タクトイドを核形成および成長させます。 6. 蛍光顕微鏡 タクトイドをイメージングするために蛍光顕微鏡を使用してください。注:全反射蛍光顕微鏡または回転ディスク共焦点顕微鏡は、遊離チューブリンからバックグラウンド蛍光を除去するのに適していますが、タクトイドは、形成された後に通常の落射蛍光および透過光顕微鏡によっても見えるため、この手順は特別な装置なしでアクセス可能です。 開口数(NA)の対物レンズを1.2NA以上、倍率60倍以上で使用して、蛍光で十分な光を集めます。これらの目標は、多くの場合、ddH2Oまたはオイルのいずれかに浸漬する必要があります。 CMOSまたはCCDカメラで画像を記録します。108 nm のカメラで有効ピクセル サイズを使用します。メモ:ピクセルサイズは、カメラと使用する倍率によって異なりますが、この場合は60倍または100倍で、大口径(1.2または1.49 NA)でした。カメラの前に追加の画像エキスパンダーを使用して、必要なピクセルサイズを実現できます。 この温度に設定した環境チャンバーを用いて試料を37°Cに保った。あるいは、熱風ステージヒーターや温水を循環させる客観的な温度制御カラーなど、他のステージヒーターを採用してください。 必要な蛍光に適した励起源を使用してください。ローダミンチューブリンの場合は、サンプルで少なくとも1mWのパワーを持つ561nmレーザーを使用し、GFP-MAP65の場合は、サンプルで少なくとも1mWのパワーを持つ488nmレーザーを使用します。メモ:広視野落射蛍光顕微鏡を使用する場合は、励起:540 ± 12.5 nm、ダイクロイック:545 nm ± 12.5 nmカットオフ、発光:575 nmロングパス、励起:480 ± 15 nm、ダイクロイック:505 nm±15 nmカットオフ、および発光:515 nmロングパスのローダミンフィルターキューブを使用してください。 異なる領域の少なくとも10枚の画像を撮影して、100枚以上のタクトイドを画像化します。赤チャンネルと緑チャンネルの両方で画像を撮影し、分析のために16ビットTIFF画像として保存します。照明パワーと露出時間が、カメラの強度スケールが飽和していないことを確認してください。 7. フォトブリーチング後の蛍光回復(FRAP) 注:タクトイドの内部構成要素の移動性を調べるために、FRAPが使用された。FRAPは、ローダミン標識チューブリンおよびGFP標識MAP65タクトイドの選択された部分をフォトブリーチングし、その領域における時間とともに蛍光の回復を観察することによって機能する。回復速度は、光漂白される種の回転に依存する。このターンオーバー速度は、拡散および結合反応に依存し得る。タクトイドへのMAP65結合について、結合交換速度を推定することができる。FRAPは、任意の形状のレーザーをスキャンできる追加の405nmレーザーシステムを使用して実行されます。FRAPを行うには、局所領域14をフォト漂白するために透過ランプおよび絞りを使用することを含む多くの可能性がある。 チャンバ内の孤立したタクトイドを選択して、タクトイドの一部と周囲の溶液を覆う関心領域(ROI)を作成します。 FRAP用の追加の405nmレーザーを備えた顕微鏡を使用して、チューブリンとMAP65の両方を同時に光漂白します。あるいは、明るいランプを、虹彩14のフィールドストップを介して使用することができる。フォトブリーチングシステムの特定の強度を経験的に調整して、ブリーチング中のタンパク質の損傷を回避します。 フォトブリーチングの前に30〜60秒間、タクトイドを時系列ムービーとして記録して、漂白剤の前の強度に関する情報を取得します。赤と緑のチャンネルの両方を録音します。 タクトイドを損傷することなく光漂白するために必要な限りレーザーまたはランプのいずれかでROIを露光することによってタクトイドをフォトブリーチする。強度と時間を経験的に決定します。 フォトブリーチング後5〜10分間、または回復が平衡に達したと思われるまで、両方のカラーチャンネルでムービーを録画し続けます。 GFP-MAP65チャネルのリカバリを目視で確認します。 8. データ解析 注:タクトイドの画像の定量的分析は、異なるクラウディング剤、イオン条件、および他の要因の付加を介して課せられる環境変化の影響について学ぶために実施された。 タクトイド形状特性評価共焦点顕微鏡で撮影した赤と緑の画像からタクトイドの長さと幅を定量化します。 フィジー/イメージJを使用して画像を開きます。 生データを16ビットで取得する場合は、必要に応じて明るさとコントラストを調整します。[ 画像]>[明るさとコントラスト> 調整]を選択して、タクタイドをはっきりと見ることができるように画像を調整します。誤って強度データを変更しないように、設定を適用せずに明るさとコントラストを調整してください。 タクトイドがはっきりと見えたら、測定する良いタクトイドを選択します(図4Bi)。タクトイドが他のタクトイドや凝集体と重なることなくはっきりと見え、直線測定ツールを使用できるように湾曲したり曲がったりしていないことを確認します。 次に、画像に正しいピクセルサイズが設定されていることを確認します。顕微鏡画像には、ピクセルサイズに関するメタデータが付属しています。メタデータを持たない別のカメラや、予想される有効ピクセルサイズを変更できる外部画像拡張システムを使用する場合は、ピクセルサイズを手動で調整します。FIJI/ImageJ で、[ 分析] > [スケールの設定] に移動して、正しいピクセル変換を設定します。 FIJI/ImageJのツールバーの 直線 ツールを使用して、タクトイドの一方の端をクリックし、カーソルをタクトイドのもう一方の端にドラッグします(図4Bii)。ラインROIを選択したら、[ 分析]>[測定] を選択して長さを測定します。長さがデフォルトで測定されない場合は、[分析] または [測定値の設定] ダイアログ ボックスで長さを含めるように 測定>設定 してください。メモ: 通常、[ 直線] ツールを使用して測定する場合、描画される線の長さと角度が表示されます。例として、 図4Bii は、タクトイドを見えるようにするためにタクトイドの側面に描かれた直線を示していますが、タクトイド上で直接測定を行います。 測定後、ツールバーの テキスト ツールを使用してタクトイドにラベルを付けます。テキスト ボックスを作成し、数値ラベルを追加し、[ 編集] > [描画] を選択して、ラベルをイメージに固定します。イメージを別のROIファイルとして保存します。注: このファイルにラベルを付けて保存すると、研究者は、どの測定値が生データのどのタクトイドに対応しているかを知ることができます。各タクトイドを一度測定してください。 画像全体のタクトイドが測定されたら、「 結果 」ウィンドウのデータをコンマ区切りまたはタブ区切りのテキスト・ファイルに保存し (「 ファイル」または「名前を付けて保存」を使用)、スプレッドシート・プログラムでデータ>開いてデータを数値に解析します。すべてのデータ (生の画像データ、ROI 画像、および結果のテキスト ファイル) をまとめて、適切な命名規則を持つフォルダーに集めて、すべてを整理します。注:タクチイドの長さの測定は手作業で行われますが、タクトイドの幅が狭いため、測定誤差を減らすために別のタクトイド幅の測定方法(下記参照)を使用することをお勧めします。 ImageJ/FIJIを使用して、 直線ツールを使用して線 領域を描画します。タクトイドの長軸に垂直な二等分線として線を引きます(図4Bii)。 プロットプロファイル>分析を選択して、線形二等分線の強度プロファイルを作成します(図4Biii)。プロットが表示されます。プロットからデータを取得して保存するには、左下のリストボタンを選択します。これにより、描画された線の長さに沿った強度データのテキストファイルリストが生成されます。テキスト ファイルを.csvファイルまたは.txtファイルとして保存します。 MatLab、Python (sciPy)、またはその他のプログラムなどの適切なプログラムでテキストファイルを開きます。強度データを次の形式のガウス関数で適合します。ここで、I(x) は長さ x に沿ったグレースケール値です。B はバックグラウンド レベルです。A はガウスの振幅です。μはガウスの平均または中心です。σはガウスの標準偏差です。 報告書2は、タクトイドの幅としてσ する。タクトイド内の微小管の強度を推定するには、ガウス下の面積(背景を含まない)を計算します。注:画像がカメラの線形強度範囲内にあり、同じ露光時間と励起強度で撮影された場合、積分強度を比較して、タクトイド内の微小管の相対数を推定することができます。 フラップ解析注:微小管およびMAP65の移動度を試験する実験では、FRAPを使用して、分子運動による強度の特異的なフォトブリーチングおよび回復を記録した(図5A)。データは、ImageJ/FIJIを用いて画像時系列データから定量化した。 ImageJ/FIJIを使用して、ムービーデータを開きます。 時間の経過とともにスタック (時系列データ) を登録して、ドリフトを除去します。 StackRegプラグイン を補助的な TurboReg プラグインと一緒に使用してください。プラグインの使用方法については、 資料表に記載されているウェブリンクを参照してください。平行移動を選択すると、フレームの位置がシフトされ、画像が登録されます。 ドリフトを除去するために画像が登録されたら、[画像]または[変換]または[回転]を選択して、タクトイドがフレーム内で垂直または水平 になるように画像>回転>ます。回転する角度を選択し、「 プレビュー」 を使用して、タクトイドが十分に回転しているかどうかを確認します。プレビューでタクトイドが垂直または水平のいずれかであることが示されたら、「 OK」 を選択してムービー内のすべての画像を回転させます。 ツールバーの長方形選択ツールを使用して、タクトイドのフォトブリーチング領域の上に長方形断面を作成します。各フレームのROI領域の積分強度を、画像>スタック>測定スタックを使用して記録します。「分析」または「測定の設定」を使用して、測定タイプを「統合密度」>設定します。「結果」ウィンドウに表示される分析強度データを、「ファイル」または「別名で保存」を選択して、.csvまたは.txt形式のテキストファイルとして保存>ます。メモ: 図5B は、漂白剤領域の微小管およびGFP-MAP65チャネルについて測定された生の16ビット強度データの例を示しています。 画像の全体的な強度は、画像によって引き起こされるフォトブリーチングのためにグローバルに時間の経過とともにフェードアウトするため、このグローバルフォトブリーチングを修正する必要があります。これを行うには、同じROIサイズを使用し(ステップ8.2.4)、微小管またはMAP65が見えない画像の背景の領域に移動します。ステップ 8.2.4 の説明に従って、スタックの積分強度を測定します。結果を 2 番目のテキスト ファイルとして保存します。メモ: 図5B は、バックグラウンド領域の微小管およびGFP-MAP65チャネルについて測定された生の16ビット強度データの例を示しています。 背景のフェードを補正するには、タクタイドの信号強度を同じ時点の背景強度で除算します。ここで、IS(t)(信号)は漂白領域で行われた測定であり、BG(t)(ノイズ)はバックグラウンド領域で行われた測定です(図5C)。これにより、各フレームの信号対雑音比が計算され、ノイズも減算されます。 次に、 を使用してデータを 0 から 1 の範囲に再スケーリングします。ここで、I minとImaxは、それぞれ、全時間にわたって補正されたデータのグローバルな最小値と最大値を示します(図5C)。 このデータを、次の形式の減衰指数に当てはめます。 ここで、 A は回復の振幅、τ は回復のタイムスケールです (図 5C)。