מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים
Summary
Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.
Abstract
מערכות מיקרופלואידיות שיפרו מאוד את טכניקות הבדיקה החיסונית. עם זאת, טכניקות מיקרו-פבריקציה רבות דורשות ציוד מיוחד, יקר או מסובך, מה שהופך את הייצור ליקר ולא תואם לייצור המוני, שהוא אחד התנאים המוקדמים החשובים ביותר לאימוץ בדיקות נקודת טיפול (POCT) בסביבה דלת משאבים. עבודה זו מתארת את תהליך הייצור של מכשיר אקרילי (פולימתיל-מתקרילט, PMMA) לבדיקת אימונואסאי אנזימטי מצומד בננו-חלקיקים באמצעות טכניקת המיקרו-מילינג של בקרה נומרית ממוחשבת (CNC). תפקודו של המכשיר המיקרופלואידי מוצג על ידי ביצוע בדיקה חיסונית לאיתור נוגדן מסחרי באמצעות ליזוזים כאנטיגן מודל המצומד לננו-חלקיקים מגנטיים של 100 ננומטר. מכשיר זה משלב מגבלה פיזיקלית של 5 מיקרומטר בלבד בגובה, המשמשת ללכידת מיקרו-חלקיקים מגנטיים המרכיבים מלכודת מגנטית על ידי הצבת מגנט חיצוני. בדרך זו, הכוח המגנטי על התמיכה החיסונית של ננו-חלקיקים מצומדים מספיק כדי ללכוד אותם ולהתנגד לגרירת זרימה. מכשיר מיקרופלואידי זה מתאים במיוחד לייצור המוני בעלות נמוכה ללא אובדן הדיוק לביצועי החיסון.
Introduction
בשנים האחרונות, מיקרופלואידיקה מילאה תפקיד חשוב בטכניקות אימונואסאי1. לטכנולוגיית המזעור יש יתרונות בולטים רבים בהשוואה לחיסוניות מסורתיות, כגון צריכת דגימה וריאגנטים מופחתת, זמני דגירה קצרים יותר, החלפת פתרונות יעילה ואינטגרציה ואוטומציה גבוהות יותר2.
יתר על כן, מערכות מיקרופלואידיות ב- immunoassays, בשיתוף עם ננו-חלקיקים מגנטיים כתמיכה חיסונית, מפחיתות במידה ניכרת את זמני הדגירה, ומשיגות רגישות גילוי גבוהה בשל היחס המוגבר בין פני השטח לנפח3. תנועה בראונית של החלקיקים משפרת את קינטיקה התגובה במהלך היווצרות קומפלקס אנטיגן-נוגדנים 4,5. יתר על כן, התכונות המגנטיות של ננו-חלקיקים מספקות את הרבגוניות שיש לשלב בתצורות שונות של התקנים מיקרופלואידיים, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים לאיתות וללכידת מולקולות במערכות ביוסנסינג ממוזערות על השבב5. עם זאת, הכוחות המגנטיים חלשים משמעותית מכוחות הגרר בקנה מידה ננומטרי בשל היחס הגבוה בין פני השטח לנפח6. לכן, לכידת ננו-חלקיקים עבור שלבים חיוניים של בדיקה חיסונית כגון שטיפה וזיהוי יכולה להיות מאתגרת, ומגנט קונבנציונלי אינו מספיק4.
דרך יעילה לתמרן את הננו-חלקיקים היא שימוש במלכודת מגנטית מיקרופלואידית הנוצרת על ידי מיקרו-חלקיקי ברזל, הארוזים במבנה מיקרופלואידי3. לכן, כאשר מגנט חיצוני מתקרב, נוצרת אינטראקציה מורכבת בתוך התווך הנקבובי הממוגנט בין הכוחות המגנטיים לכוחות השטף. הכוח המגנטי הפועל על הננו-חלקיקים חזק מספיק כדי ללכוד אותם ולהתנגד לגרר זרימה 3,4,7. גישה זו דורשת טכניקות מיקרו-פבריקציה שמשיגות רזולוציות בסדר גודל של כמה מיקרומטרים כדי ליצור מבנים מיקרומטריים ששומרים על המיקרו-חלקיקים.
טכניקות המיקרו-פבריקציה הנוכחיות מאפשרות ייצור ברזולוציה גבוהה של מבנים ממיקרונים בודדים ועד מאות ננומטרים8. עם זאת, רבות מהטכניקות הללו דורשות ציוד מיוחד, יקר או מסובך. אחד הקשיים העיקריים הוא הדרישה לחדר נקי לייצור עובש, שנותר יקר וגוזל זמןרב 8,9. לאחרונה, מהנדסים microfluidic התגברו על חיסרון זה על ידי פיתוח מגוון של שיטות ייצור חלופיות, עם יתרונות שונים כגון עלויות מופחתות, זמני אספקה מהירים יותר, חומרים וכלים זולים יותר, ופונקציונליות מוגברת8. בדרך זו, הפיתוח של טכניקות מיקרו-פבריקציה חדשות הביא לשיטות בעלות נמוכה, שאינן נקיות, המשיגות רזולוציות נמוכות עד 10 מיקרומטר8. ניתן להשתמש בדפוסים ישירות על מצע מבלי ליצור תבנית יציקה יקרה, ובכך להימנע מתהליך גוזל זמן. שיטות ייצור ישירות כוללות כרסום CNC, אבלציה בלייזר וליתוגרפיה ישירה8. כל השיטות הללו מתאימות לייצור תעלות בעלות יחס רוחב-גובה גבוה במגוון רחב של חומרים, ללא קשר לקשיותן9, ומאפשרות גיאומטריות, התנהגויות פיזיקליות ואיכויות חדשות ומועילות בהתקנים מיקרופלואידיים8.
מיקרומילינג CNC יוצר מבנים בקנה מידה זעיר באמצעות כלי חיתוך המסירים חומר בתפזורת ממצע ומהווה שיטת ייצור יעילה להתקנים מיקרופלואידיים10,11. טכניקת המיקרומילינג יכולה להיות שימושית ביישומים מיקרופלואידיים ליצירת מיקרו-ערוצים ותכונות ישירות על משטח העבודה, ומציעה יתרון מרכזי: ניתן לייצר חומר עבודה בזמן קצר (פחות מ-30 דקות), ובכך להפחית משמעותית את זמן האספקה מתכנון לאב טיפוס12. בנוסף, הזמינות הרחבה של אביזרי חיתוך מחומרים, גדלים וצורות שונות הופכת את מכונות כרסום CNC לכלי מתאים שאיפשר ייצור תכונות שונות בסוגים רבים של חומרים חד פעמיים בעלות נמוכה13.
מבין כל החומרים הנפוצים בשימוש במיקרומיל, תרמופלסטיקה נותרה בחירה מובילה בשל תכונותיהם החיוביות הרבות ותאימותם ליישומים ביולוגיים10,14. תרמופלסטיקה היא מצע אטרקטיבי למערכות מיקרופלואידיות בשל יתרונותיה המשמעותיים לפיתוח מערכות אנליטיות חד פעמיות בעלות נמוכה9. בנוסף, חומרים אלה מקובלים מאוד על תהליכי ייצור בנפח גבוה, מה שהופך אותם מתאימים למסחור וייצור המוני. מסיבות אלה, תרמופלסטיקה כגון PMMA נחשבה לחומרים אמינים וחזקים מאז השנים הראשונות של מיקרופלואידיקה10. פרוטוקולים שונים תוארו כדי לייצר תעלות סגורות בתרמופלסטיקה, כגון מליטה ממס15, מליטה בחום 16, ומליטה אולטרה סגולה (UV)/אוזון טיפול פני שטח17.
במקרים רבים, רזולוציית המיקום שהושגה באמצעות מכונות מיקרומילינג קונבנציונליות אינה מספיקה עבור יישומים מיקרופלואידיים מסוימים הדורשים מבנים הקטנים מ-10 מיקרומטר. למיקרומילינג מתקדם יש רזולוציה מספקת. למרבה הצער, בשל מחירים גבוהים, השימוש בו מוגבל לקומץ משתמשים12. בעבר, קבוצת המחקר שלנו דיווחה על ייצור ומניפולציה של כלי בעלות נמוכה המאפשר מבני עיבוד שבבי של פחות מ -10 מיקרומטר, תוך התגברות על הרזולוציה של מכונות כרסום קונבנציונליות12. המתקן הוא פלטפורמה המיוצרת על ידי הדפסה תלת מימדית עם אלקטרוניקה פשוטה, המכילה שלושה מפעילים פיאזואלקטריים. המשטח מכיל חיבורים בצורת ציר המאפשרים לו להיות מורם כאשר האלמנטים הפיאזואלקטריים פועלים בו זמנית. ניתן לשלוט בתזוזה של ציר Z ברזולוציה של 500 ננומטר ובדיוק של ±1.5 מיקרומטר12.
מאמר זה מציג את שלבי תהליך הייצור של מכשיר אקרילי (PMMA) באמצעות טכניקת מיקרומילינג. עיצוב השבב מורכב מערוץ ראשי ברוחב 200 מיקרומטר ובגובה 200 מיקרומטר וערוץ צדדי עם אותם ממדים כדי לטהר את זרימת הריאגנטים. באזור המרכז, הערוץ מופרע על ידי הגבלה פיזיקלית של גובה של 5 מיקרומטר בלבד, המיוצרת עם הפלטפורמה הפיאזואלקטרית המודפסת בתלת-ממד מתוצרת קבוצהזו 12, כדי ללכוד מיקרו-חלקיקים מגנטיים המרכיבים מלכודת מגנטית עבור ננו-חלקיקים על ידי הצבת מגנט חיצוני. אנו מראים את פעולתו של המכשיר המיקרופלואידי על ידי ביצוע בדיקה חיסונית לאיתור נוגדן מסחרי באמצעות ליזוזים כאנטיגן מודל המצומד לננו-חלקיקים מגנטיים של 100 ננומטר. מכשיר זה משלב תכונות שונות שהופכות אותו לייחודי4: השימוש בננו-חלקיקים מגנטיים כתמיכה במערכת החיסון מפחית את זמן הבדיקה הכולל משעות לדקות; שימוש באנזים פלואורוגני לזיהוי מאפשר מגבלות זיהוי דומות לאלה של בדיקות אימונוסורבנט סטנדרטיות הקשורות לאנזים (ELISAs); והשימוש בתרמופלסטי כחומר ייצור הופך אותו לתואם לייצור המוני, מה שלא היה המקרה של ננו-חלקיקים מיקרופלואידיים קודמים3, והופך אותו למועמד מצוין לפיתוח POCT.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר מיקרופלואידי אקרילי לאימונו-אנליזות תוך שימוש בננו-חלקיקים כתמיכה חיסונית יוצר בטכניקת מיקרו-מילינג. השיטה של ייצור ישיר על המצע יש את היתרון של הימנעות משימוש בתבנית מאסטר ואת הזמן והעלויות כי זה מרמז. עם זאת, הוא מוגבל לבניית אב-טיפוס מהירה ולייצור מכשירים בנפח גבוה.
<p class="jove_conten…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Conacyt, מקסיקו תחת מענק 312231 של “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación”, ועל ידי AMEXCID ומשרד יחסי החוץ המקסיקני (SRE) תחת מענק “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO מודה לקונסיט מקסיקו על מלגת הדוקטורט שלהם.
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
Riferimenti
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
