Настоящий протокол описывает удобный подход к интеграции оптического улавливания и поверхностно-расширенной рамановской спектроскопии (SERS) для манипулирования плазмонными наночастицами для чувствительного молекулярного обнаружения. Без агрегирующих агентов улавливающий лазер собирает плазмонные наночастицы для усиления сигналов SERS целевых аналитов для спектроскопических измерений in situ .
Поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия (SERS) позволяет сверхчувствительно обнаруживать молекулы анализируемого вещества в различных приложениях благодаря усиленному электрическому полю металлических наноструктур. Солеобразная агрегация наночастиц серебра является наиболее популярным методом генерации SERS-активных подложек; однако он ограничен плохой воспроизводимостью, стабильностью и биосовместимостью. Настоящий протокол объединяет оптические манипуляции и обнаружение SERS для разработки эффективной аналитической платформы для решения этой проблемы. Улавливающий лазер 1064 нм и рамановский зондовый лазер 532 нм объединены в микроскоп для сборки наночастиц серебра, которые генерируют плазмонные горячие точки для измерений SERS in situ в водных средах. Без агрегирующих агентов эта динамическая сборка плазмонных наночастиц серебра обеспечивает примерно 50-кратное усиление сигнала молекулы анализируемого вещества. Кроме того, он обеспечивает пространственное и временное управление для формирования SERS-активной сборки всего в 0,05 нМ раствора наночастиц серебра с аналитическим покрытием, что сводит к минимуму потенциальное возмущение для анализа in vivo . Следовательно, эта оптическая платформа SERS, интегрированная в улавливание, обладает большим потенциалом для эффективного, воспроизводимого и стабильного молекулярного анализа в жидкостях, особенно в водных физиологических средах.
Поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия (SERS) является чувствительным аналитическим методом для непосредственного обнаружения химической структуры молекул-мишеней в сверхнизких концентрациях или даже на уровне одноймолекулы 1,2,3,4. Лазерное облучение индуцирует локализованный поверхностный плазмонный резонанс в металлических наноструктурах, используемых в качестве подложек SERS для усиления рамановских сигналов молекул-мишеней. Солеобразные наночастицы являются широко используемыми субстратами SERS, которые спонтанно подвергаются броуновскому движению в коллоидных суспензионных жидкостях 5,6. Дальнейшая сушка позволяет проводить стабильные измерения SERS; однако может возникнуть концентрация примесей, которая создает фоновый шум и наносит необратимый ущерб биологическим образцам7. Следовательно, целесообразно разрабатывать бессолевые агрегации наночастиц, контролировать их движение в растворе и улучшать биосовместимость при сохранении эффективности измерений.
Оптический захват был принят для контроля различных металлических подложек и облегчения обнаружения SERS 8,9,10,11,12,13,14. Оптическая ловушка генерируется путем плотной фокусировки лазерного луча для создания оптического силового поля, которое притягивает небольшие объекты в область наибольшей интенсивности вокруг фокуса15,16. В последнее время оптические ловушки используются для разработки воспроизводимых и чувствительных плазмонных сенсорных платформ для различных применений, демонстрируя свои уникальные преимущества в обнаружении и контроле положения SERS-активных металлических наноструктур в решениях 17,18,19,20,21,22,23,24 . Настоящий протокол вводит подход к объединению оптического пинцета и рамановской спектромископии для динамической сборки наночастиц серебра (AgNP) и стабилизации их против броуновского движения в решении для эффективных измерений SERS. В области сборки AgNP сигнал 3,3′-дитиобиса[6-нитробензойной кислоты] бис(сукцинимидного) эфира (DSNB), молекул анализируемого вещества, покрытых на поверхности AgNP, может быть усилен примерно в 50 раз. Этот подход подходит для анализа чувствительных биомолекул, несовместимых с химическими укупорочными агентами 25,26,27. Кроме того, он обеспечивает пространственное и временное управление для создания SERS-активной сборки AgNP. Это позволяет обнаруживать in situ в водных средах, что может снизить использование AgNP и свести к минимуму возмущения для анализа in vivo 28,29,30. Кроме того, сборка AgNP, индуцированная оптическим улавливанием, стабильна, воспроизводима и обратима31,32. Следовательно, это перспективная платформа для обнаружения молекул анализируемого вещества в растворах и в физиологических условиях, когда агрегация, вызванная солью, неприменима.
В настоящем исследовании улавливающий лазер 1064 нм, модуль обнаружения силы и источник яркого освещения интегрированы в систему оптической микроскопии пинцета для оптического манипулирования и визуализации частиц. 532-нм рамановский зондовый лазер также был включен в микроскоп и выровнен с улавливающим лазером в камере образца. Для получения спектра обратно рассеянный свет собирали и перенаправляли в спектрометр (рисунок 1).
В настоящем исследовании сообщается об аналитической платформе, которая сочетает в себе оптический захват и обнаружение SERS для молекулярных характеристик in situ . 532-нм рамановский зондовый луч был объединен с 1064-нм улавливающим лазерным лучом через стерео двухслойные пути для объединения фокусировки и сбора для дополнительных спектроскопических измерений в геометрии обратного рассеяния. Улавливающий лазерный луч собирал AgNP для формирования плазмонных горячих точек с последующим возбуждением рамановского зондового лазерного луча для генерации сигнала SERS молекул анализируемого вещества в растворе. В качестве доказательства концепции было продемонстрировано обнаружение DSNB, которое было покрыто на поверхности AgNP. В области сборки AgNP, контролируемой улавливающим лазерным лучом, было достигнуто примерно 50-кратное улучшение сигнала DSNB по сравнению с окружающими дисперсными AgNP. Получено аналогичное высокосигнальное усиление молекул анализируемого вещества в измерениях растворно-фазы SERS на представленной платформе.
Критическим шагом, влияющим на усиление сигнала SERS, является формирование сборки AgNP, индуцированной оптическим улавливанием. Сигнал SERS молекул анализируемого вещества может быть оптимизирован путем тонкой настройки экспериментальных параметров, таких как мощность улавливающего лазера, время облучения и концентрация AgNP. Как показано на рисунке 8, использование более высокой мощности улавливающего лазера может повысить эффективность формирования сборки AgNP. Воспроизводимые сборки AgNP были получены путем увеличения мощности улавливающего лазера с 450 мВт до 700 мВт. Однако мощность улавливающего лазера выше 950 мВт может вызвать перегрев и генерацию пузырьков38. Таким образом, для создания динамической сборки AgNP рекомендуется лазер умеренной улавливающей мощности. Аналогичным образом, более длительное время облучения полезно для содействия формированию сборок AgNP. На рисунке 8В показано, что четкий сферический агрегат AgNP образовался при увеличении времени облучения с 5-20 с. Однако сборка AgNP была искажена после облучения 60 с. Кроме того, формирование сборки AgNP ускорялось при более высокой концентрации AgNP, с 0,01 нМ до 0,05 нМ, при этом она быстро перегревалась при 0,25 нМ, как показано на рисунке 8C. Если нет видимого образования сборки AgNP, рекомендуется увеличить мощность улавливающего лазера и время облучения. После создания стабильного агрегата AgNP улавливающий лазер должен быть отключен, чтобы избежать потенциального теплового повреждения.
Активность SERS в сборке AgNP, индуцированной оптическим улавливанием, объяснялась увеличением локальной концентрации AgNP в области лазерного облучения, которая является темным пятном на рисунке 6B. В текучем растворе AgNP оптическая ловушка может непрерывно притягивать AgNP для накопления и формирования плазмонных горячих точек в ограниченном пространстве в межчастичных соединениях. Это дает усиленное электрическое поле, которое усиливает эффект SERS. Это было дополнительно подтверждено более сильным сигналом SERS, полученным при более высокой концентрации AgNP (1,00 нМ) по сравнению с более слабым сигналом SERS, полученным при более низкой концентрации AgNP (0,05 нМ) без улавливающего лазера, как показано на рисунке 6E.
Кроме того, контроль положения плазмонного агрегата AgNP в растворе против броуновского движения с помощью оптического улавливания значительно повысил эффективность и стабильность измерений SERS. Высокопроизводительное зондирование может проводиться при подключении к микрофлюидной системе. По сравнению с традиционной солевой агрегацией наночастиц для генерации SERS-активных субстратов, наша платформа позволяет динамически формировать плазмонные сборки AgNP в заданном месте и моменте с высокой гибкостью26,28. Кроме того, он эффективно работает при наномолярных концентрациях AgNP и позволяет пространственно-временные манипуляции с активными горячими точками SERS для спектроскопических измерений in situ в растворах. Эта динамическая сборка AgNP постепенно разбиралась в течение нескольких минут, когда улавливающий лазер был выключен. Без улавливающего лазера сборка AgNP почти исчезла за 20 минут, как показано на дополнительном рисунке 1. Это может минимизировать влияние на систему обнаружения и демонстрирует большой потенциал для различных биоприложений, особенно для обнаружения биомолекул (ДНК, РНК и белка) в физиологических и in vivo условиях. Однако эта динамическая сборка AgNP обеспечивает меньший коэффициент усиления, чем агрегаты AgNP2, индуцированные солью, и, следовательно, требуется дальнейшая модификация и развитие.
В заключение, интеграция оптического улавливания и обнаружения SERS обеспечивает удобный метод управления плазмонными наночастицами и достижения воспроизводимого усиления сигнала SERS для обнаружения молекул анализируемого вещества в растворах с высокой эффективностью, стабильностью и биосовместимостью.
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем финансовую поддержку со стороны Комиссии по науке, технике и инновациям муниципалитета Шэньчжэня (No. JCYJ20180306174930894), Муниципальное бюро науки и техники Чжуншань (2020AG003) и Совет по исследовательским грантам Гонконга (проект 26303018). Мы также выражаем признательность профессору Чи-Мин Че и его финансовой поддержке со стороны «Лаборатории синтетической химии и химической биологии» в рамках программы Health@InnoHK, запущенной Комиссией по инновациям и технологиям правительства Специального административного района Гонконг Китайской Народной Республики.
1064 nm trapping laser | IPG Photonics, United States | 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W | ||
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester | Biosynth Carbosynth | FD15467 | ||
532 nm Raman excitation source | CNI, China | MLL-III-532 | ||
Bluelake software | LUMICKS, Netherlands | version 1.6.12 | optical tweezer control software | |
Frame tape | Thermo Fisher Scientific, Inc | AB-0576 | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories, Inc | 16482 | ||
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera | Teledyn Princeton Instrument, United States | 400B eXcelon | ||
Long-pass dichroic mirror | AHF, Germany | F48-801 | ||
Magnetic laser safety screen | ThorLabs | TPSM2 | ||
Optical tweezer microscope | LUMICKS, Netherlands | m-trap | ||
Silver nitrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S8157 | ||
Spectrometer | Teledyn Princeton Instrument, United States | IsoPlane SCT-320 | ||
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S4641 | ||
WinSpec software | Teledyn Princeton Instrument, United States | version 2.6.24.0 | spectrum software |