Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Farede, bu süreç embriyonik günde (E) 9.5’te, frontonazal belirginliğin oluşumu ve her biri göç sonrası kraniyal nöral krest hücreleri içeren maksiller ve mandibuler süreçlerin çiftleri ile başlar. Lateral ve medial burun süreçleri, burun çukurlarının görünümü ile frontonazal belirginlikten kaynaklanır ve sonunda burun deliklerini oluşturmak için kaynaşır. Ayrıca, medial burun süreçleri ve maksiller süreçler üst dudağı oluşturmak için kaynaşır. Aynı zamanda, palatogenez, E11.5’teki maksiller süreçlerin oral tarafından farklı çıkıntıların – ikincil damak raflarının – oluşumu ile başlatılır. Zamanla, damak rafları dilin her iki tarafında aşağı doğru büyür, dilin üzerinde zıt bir konuma yükselir ve sonunda burun ve ağız boşluklarını E16.5¹ ile ayıran sürekli bir damak oluşturmak için orta hatta kaynaşır.

Kraniofasiyal gelişim boyunca bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Örneğin, kemik morfogenetik protein reseptörleri (BMPR’ler) ve çeşitli reseptör tirozin kinaz (RTK) aileleri de dahil olmak üzere dönüştürücü büyüme faktörü (TGF)-β reseptörlerinin alt aileleri gibi hücre zarı reseptörleri, kranial nöral krest hücrelerinde ligand bağlanması ve aktivasyonu üzerine otofosforile edilir ^2,3,4 . Ek olarak, G proteinine bağlı transmembran reseptörü Smoothized, kraniyal nöral krest hücrelerinde fosforile olur ve Patched1 reseptörüne bağlanan Sonik kirpi (SHH) ligandının aşağı yönünde kraniyofasiyal ektoderm haline gelir ve siliyer membranda Düzgünleştirilmiş birikim ve SHH yolu aktivasyonu⁵ ile sonuçlanır. Bu tür ligand-reseptör etkileşimleri, kraniyofasiyal bağlamlarda otokrin, parakrin ve / veya jukstacrin sinyalizasyonu yoluyla ortaya çıkabilir. Örneğin, BMP6’nın kondrosit farklılaşması⁶ sırasında otokrin bir şekilde sinyal verdiği bilinirken, fibroblast büyüme faktörü (FGF) 8, faringeal ark ektoderminde ifade edilir ve faringeal ark mezenkiminde eksprese edilen FGF RTK ailesinin üyelerine parakrin bir şekilde bağlanır^{7, 8,9,10}. Ayrıca, Kraniofasiyal iskelet gelişimi sırasında hem kondrositlerde hem de osteoblastlarda, transmembran Delta ve / veya Pürüzlü ligandlar komşu hücrelerdeki transmembran Çentik reseptörlerine bağlandığında, daha sonra parçalanan ve fosforile edilen yan yana takrin sinyallemesi yoluyla aktive edilir¹¹. Bununla birlikte, hem otokrin hem de parakrin sinyallemede işlev görme esnekliğine sahip kraniyofasiyal gelişim için önemli olan başka ligand ve reseptör çiftleri de vardır. Örnek olarak, murin diş morfogenezi sırasında, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)-AA ligandının, emaye organ epiteli^12’deki RTK PDGFRa’yı aktive etmek için otokrin bir şekilde sinyal verdiği gösterilmiştir. Buna karşılık, gebeliğin ortasındaki murin fasiyal süreçlerinde, PDGF-AA ve PDGF-CC ligandlarını kodlayan transkriptler kraniyofasiyal ektodermde eksprese edilirken, PDGFRα reseptörü altta yatan kranial nöral krest kaynaklı mezenkimde eksprese edilir ve parakrin sinyalizasyonu^{13,14,15,16,17} ile sonuçlanır. . Sinyal mekanizmasından bağımsız olarak, bu reseptör fosforilasyon olayları genellikle mitojenle aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu^18,19 gibi hücre içi kinaz kaskadlarını başlatmak için sıklıkla fosforile haline gelen adaptör proteinlerinin ve / veya sinyal moleküllerinin işe alınmasıyla sonuçlanır.

Bu kaskadların terminal hücre içi efektörleri daha sonra transkripsiyon faktörleri, RNA bağlanması, hücre iskeleti ve hücre dışı matriks proteinleri gibi bir dizi substratı fosforile edebilir. Runx2²⁰, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24,^Gli1-3 25 ve Sox9 ²⁶, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilen transkripsiyon faktörleri arasındadır. Bu translasyonel sonrası modifikasyon (PTM), diğer aktivitelerin yanı sıra alternatif PTM’lere duyarlılığı, dimerizasyonu, stabiliteyi, bölünmeyi ve / veya DNA bağlayıcı afiniteyi doğrudan etkileyebilir^20,21,25,26. Ek olarak, RNA bağlayıcı protein Srsf3, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilir ve nükleer translokasyonuna yol açar²⁷. Genel olarak, RNA bağlayıcı proteinlerin fosforilasyonunun, hücre altı lokalizasyonlarını, protein-protein etkileşimlerini, RNA bağlanmasını ve / veya dizi özgüllüğünü etkilediği gösterilmiştir²⁸. Ayrıca, aktomiyozinin fosforilasyonu, kraniyofasiyal gelişim boyunca sitoiskelet yeniden düzenlemelerine yol açabilir^29,30 ve küçük integrin bağlayıcı ligand N’ye bağlı glikoproteinler gibi hücre dışı matriks proteinlerinin fosforilasyonu^, iskelet gelişimi sırasında biyomineralizasyona katkıda bulunur ³¹. Yukarıdaki ve diğer birçok örnekle, kraniyofasiyal gelişim sırasında protein fosforilasyonu için geniş etkileri olduğu açıktır. Ek bir düzenleme seviyesi ekleyerek, protein fosforilasyonu, fosfat gruplarını çıkararak kinazlara karşı koyan fosfatazlar tarafından daha da modüle edilir.

Hem reseptör hem de efektör molekül seviyelerindeki bu fosforilasyon olayları, sinyal yolaklarının yayılması için kritik öneme sahiptir ve sonuçta çekirdekteki gen ekspresyonunda değişikliklere neden olarak, göç, proliferasyon, hayatta kalma ve farklılaşma gibi spesifik hücre aktivitelerini yönlendirerek memeli yüzünün düzgün oluşumuna neden olur. Kinazlar ve fosfatazlarla protein etkileşimlerinin bağlam özgüllüğü, PTM’lerde ortaya çıkan değişiklikler ve bunların hücre aktivitesi üzerindeki etkileri göz önüne alındığında, fosforilasyon olaylarının kraniyofasiyal gelişime katkısının tam olarak anlaşılması için bu parametrelerin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin fosforilasyonunu ve dolayısıyla memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyal yolaklarının aktivasyonunu incelemek için iki bağlam örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri – hem birincil³² hem de ölümsüzleştirilmiş³³ . E11.5’te, maksiller süreçler lateral ve medial nazal süreçler¹ ile kaynaşma sürecindedir, böylece fare kraniyofasiyal gelişimi sırasında kritik bir zaman noktasını temsil eder. Ayrıca, maksiller süreçler ve damak raflarından türetilen hücreler burada seçilmiştir, çünkü ikinci yapılar birincisinin türevleridir, böylece araştırmacılara protein fosforilasyonunu in vivo ve in vitro olarak ilgili bağlamlarda sorgulama fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol alternatif yüz süreçleri ve gelişimsel zaman noktaları için de geçerlidir.

Fosforile proteinlerin incelenmesinde kritik bir sorun, protein izolasyonu sırasında bol miktarda çevresel fosfatazlar tarafından kolayca fosforilden arındırılmalarıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, fosforile proteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, fosforile proteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli sinyal yolaklarının dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.