Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse

Die kraniofaziale Entwicklung von Säugetieren ist ein komplexer morphologischer Prozess, bei dem sich mehrere Zellpopulationen koordinieren, um das frontonasale Skelett zu erzeugen. Bei der Maus beginnt dieser Prozess am embryonalen Tag (E) 9,5 mit der Bildung der frontonasalen Prominenz und Paaren von Oberkiefer- und Unterkieferprozessen, von denen jeder postmigratorische kraniale Neuralleistenzellen enthält. Die lateralen und medialen Nasenfortsätze entstehen aus der frontonasalen Prominenz mit dem Auftreten der Nasengruben und verschmelzen schließlich zu den Nasenlöchern. Darüber hinaus verschmelzen die medialen Nasenfortsätze und Oberkieferfortsätze zur Erzeugung der Oberlippe. Gleichzeitig wird die Palatogenese mit der Bildung von deutlichen Auswüchsen – den sekundären palatalen Regalen – von der oralen Seite der Oberkieferprozesse bei E11.5 eingeleitet. Im Laufe der Zeit wachsen die Gaumenböden auf beiden Seiten der Zunge nach unten, heben sich in eine entgegengesetzte Position über der Zunge und verschmelzen schließlich an der Mittellinie, um einen kontinuierlichen Gaumen zu bilden, der die Nasen- und Mundhöhle durch E16.5¹ trennt.

Diese morphologischen Veränderungen während der kraniofazialen Entwicklung werden durch verschiedene Signalwechselwirkungen initiiert und aufrechterhalten, zu denen häufig die Proteinphosphorylierung durch Kinasen gehört. Zum Beispiel werden Zellmembranrezeptoren, wie Unterfamilien von TGF)-β-Rezeptoren (transforming growth factor), einschließlich knochenmorphogenetischer Proteinrezeptoren (BMPRs), und verschiedener Rezeptortyrosinkinase (RTK) -Familien, bei Ligandenbindung und Aktivierung in kranialen Neuralleistenzellen autophosphoryliert ^2,3,4 . Darüber hinaus wird der G-Protein-gekoppelte Transmembranrezeptor Smoothened in kranialen Neuralleistenzellen und kraniofazialen Ektoderm stromabwärts des Sonic Hedgehog (SHH) -Liganden, der an den Patched1-Rezeptor bindet, phosphoryliert, was zu einer geglätteten Akkumulation an der Ziliarmembran und SHH-Signalwegaktivierung^{führt 5}. Solche Liganden-Rezeptor-Interaktionen können durch autokrine, parakrine und/oder juxtacrine Signalgebung in kraniofazialen Kontexten auftreten. Zum Beispiel ist bekannt, dass BMP6 während der Chondrozytendifferenzierung⁶ autokrin signalisiert, während der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) 8 im Rachenbogenektoderm exprimiert wird und an Mitglieder der FGF-Familie von RTKs bindet, die im Pharynxbogenmesenchym parakrin ausgedrückt werden, um die Strukturierung und das Auswachsen der Pharynxbögen^{einzuleiten 7, 8,9,10} Darüber hinaus wird die Notch-Signalgebung sowohl in Chondrozyten als auch in Osteoblasten während der kraniofazialen Skelettentwicklung durch Juxtacrin-Signalisierung aktiviert, wenn Transmembran-Delta- und/oder Jagged-Liganden an Transmembran-Notch-Rezeptoren auf benachbarten Zellen binden, die anschließend gespalten und phosphoryliert^{werden 11}. Es gibt jedoch andere Liganden- und Rezeptorpaare, die für die kraniofaziale Entwicklung wichtig sind und die Flexibilität haben, sowohl bei der autokrinen als auch bei der parakrinen Signalgebung zu funktionieren. Als Beispiel wurde während der Morphogenese des murinen Zahns gezeigt, dass der von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktor (PDGF)-AA-Ligand autokrin signalisiert, den RTK PDGFRα im Schmelzorganepithel¹² zu aktivieren. Im Gegensatz dazu werden bei murinen Gesichtsprozessen während der mittleren Schwangerschaft Transkripte, die für die Liganden PDGF-AA und PDGF-CC kodieren, im kraniofazialen Ektoderm exprimiert, während der PDGFRα-Rezeptor im zugrunde liegenden Schädelneuralkamm-abgeleiteten Mesenchym exprimiert wird, was zu einer parakrinen Signalgebung 13,14,15,16,17 führt. . Unabhängig vom Signalmechanismus führen diese Rezeptorphosphorylierungsereignisse häufig zur Rekrutierung von Adapterproteinen und/oder Signalmolekülen, die häufig selbst phosphoryliert werden, um intrazelluläre Kinasekaskaden wie den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) -Signalweg^18,19 zu initiieren.

Die terminalen intrazellulären Effektoren dieser Kaskaden können dann eine Reihe von Substraten phosphorylieren, wie Transkriptionsfaktoren, RNA-bindende, zytoskelettale und extrazelluläre Matrixproteine. Runx2²⁰, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24^{, Gli1-3} 25 und Sox9 ²⁶ gehören zu den Transkriptionsfaktoren, die im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert werden. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) kann sich unter anderem direkt auf die Anfälligkeit für alternative PTMs, Dimerisierung, Stabilität, Spaltung und/oder DNA-bindende Affinität auswirken^20,21,25,26. Zusätzlich wird das RNA-bindende Protein Srsf3 im Rahmen der kraniofazialen Entwicklung phosphoryliert, was zu seiner Kerntranslokation²⁷ führt. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von RNA-bindenden Proteinen ihre subzelluläre Lokalisation, Protein-Protein-Interaktionen, RNA-Bindung und / oder Sequenzspezifität beeinflusst²⁸. Darüber hinaus kann die Phosphorylierung von Actomyosin während der kraniofazialen Entwicklung zu zytoskelettalen Umlagerungen führen 29,30, und die Phosphorylierung extrazellulärer Matrixproteine, wie kleine integrinbindende Liganden-N-verknüpfte Glykoproteine^, trägt zur Biomineralisierung während der Skelettentwicklung^{bei 31}. Durch die oben genannten und zahlreiche andere Beispiele ist es offensichtlich, dass es weitreichende Implikationen für die Proteinphosphorylierung während der kraniofazialen Entwicklung gibt. Durch Hinzufügen einer zusätzlichen Regulierungsebene wird die Proteinphosphorylierung durch Phosphatasen weiter moduliert, die Kinasen entgegenwirken, indem sie Phosphatgruppen entfernen.

Diese Phosphorylierungsereignisse sowohl auf Rezeptor- als auch auf Effektormolekülebene sind entscheidend für die Ausbreitung von Signalwegen und führen letztendlich zu Veränderungen der Genexpression im Zellkern, die spezifische Zellaktivitäten wie Migration, Proliferation, Überleben und Differenzierung vorantreiben, die zu einer ordnungsgemäßen Bildung des Säugetiergesichts führen. Angesichts der Kontextspezifität von Proteininteraktionen mit Kinasen und Phosphatasen, der daraus resultierenden Veränderungen der PTMs und ihrer Auswirkungen auf die Zellaktivität ist es wichtig, dass diese Parameter in einem physiologisch relevanten Umfeld untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis des Beitrags von Phosphorylierungsereignissen zur kraniofazialen Entwicklung zu erhalten. Hier werden Beispiele für zwei Kontexte geliefert, in denen die Phosphorylierung von Proteinen und damit die Aktivierung von Signalwegen während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren untersucht werden kann: Gesichtsprozesse der Maus, insbesondere E11.5-Oberkieferprozesse, und kultivierte embryonale palatale Mesenchymzellen der Maus, die aus E13.5 sekundären palatalen Regalen stammen – sowohl primär³² als auch immortalisiert³³ . Bei E11.5 verschmelzen die Oberkieferfortsätze mit den lateralen und medialen Nasenfortsätzen¹ und stellen damit einen kritischen Zeitpunkt während der kraniofazialen Entwicklung der Maus dar. Darüber hinaus wurden hier Oberkieferprozesse und Zellen aus den palatalen Regalen ausgewählt, da letztere Strukturen Derivate der ersteren sind, was den Forschern die Möglichkeit bietet, die Proteinphosphorylierung in vivo und in vitro in verwandten Kontexten zu untersuchen. Dieses Protokoll gilt jedoch auch für alternative Gesichtsprozesse und Entwicklungszeitpunkte.

Ein kritisches Problem bei der Untersuchung phosphorylierter Proteine besteht darin, dass sie während der Proteinisolierung durch reichlich vorhandene Umweltphosphatasen leicht dephosphoryliert werden können. Um diese Barriere zu überwinden, werden Anpassungen und Modifikationen an Standardlabormethoden diskutiert, die eine Isolierung phosphorylierter Proteine ermöglichen. Darüber hinaus werden Best Practices für die ordnungsgemäße Analyse und Quantifizierung phosphorylierter Proteine bereitgestellt. Diese Techniken, insbesondere in Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren und/oder murinen genetischen Modellen, können verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle verschiedener Signalwege zu gewinnen, die während der kraniofazialen Entwicklung aktiv sind.