Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaires fusionnent pour générer la lèvre supérieure. Parallèlement, la palatogenèse est initiée par la formation d’excroissances distinctes – les plateaux palataux secondaires – du côté oral des processus maxillaires à E11.5. Au fil du temps, les étagères palatines se développent vers le bas de chaque côté de la langue, s’élèvent à une position opposée au-dessus de la langue et finissent par fusionner à la ligne médiane pour former un palais continu qui sépare les cavités nasale et buccale par E16.5¹.

Ces changements morphologiques tout au long du développement craniofacial sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Par exemple, les récepteurs de la membrane cellulaire, tels que les sous-familles de récepteurs β du facteur de croissance transformant (TGF), y compris les récepteurs de protéines morphogénétiques osseuses (BMPR) et diverses familles de récepteurs tyrosine kinase (RTK), sont autophosphorylés lors de la liaison et de l’activation du ligand dans les cellules de la crête neurale crânienne ^2,3,4 . De plus, le récepteur transmembranaire couplé à la protéine G Smoothened devient phosphorylé dans les cellules de la crête neurale crânienne et l’ectoderme craniofacial en aval de la liaison du ligand sonic hedgehog (SHH) au récepteur Patched1, ce qui entraîne une accumulation lissée au niveau de la membrane ciliaire et une activation de la voie SHH⁵. De telles interactions ligand-récepteur peuvent se produire par signalisation autocrine, paracrine et / ou juxtacrine dans des contextes craniofaciaux. Par exemple, BMP6 est connu pour signaler de manière autocrinale lors de la différenciation des chondrocytes⁶, tandis que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 8 est exprimé dans l’ectoderme de l’arc pharyngé et se lie aux membres de la famille FGF des RTK exprimés dans le mésenchyme de l’arc pharyngé de manière paracrine pour initier le modelage et l’excroissance des arcs pharyngés^{7, 8,9,10}. En outre, la signalisation Notch est activée dans les chondrocytes et les ostéoblastes pendant le développement du squelette craniofacial par la signalisation juxtacrine lorsque les ligands transmembranaires Delta et / ou Jagged se lient aux récepteurs Transmembranaires Notch sur les cellules voisines, qui sont ensuite clivés et phosphorylés¹¹. Cependant, il existe d’autres paires de ligands et de récepteurs importantes pour le développement craniofacial qui ont la flexibilité de fonctionner à la fois dans la signalisation autocrine et paracrine. À titre d’exemple, au cours de la morphogenèse des dents murines, il a été démontré que le ligand PDGF)-AA du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA signale de manière autocririne pour activer le RTK PDGFRα dans l’épithélium¹² de l’organe de l’émail. En revanche, dans les processus faciaux murins au milieu de la gestation, les transcriptions codant pour les ligands PDGF-AA et PDGF-CC sont exprimées dans l’ectoderme craniofacial, tandis que le récepteur PDGFRα est exprimé dans le mésenchyme dérivé de la crête neurale crânienne sous-jacente, ce qui entraîne une signalisation paracrine 13,14,15,16,17 . Quel que soit le mécanisme de signalisation, ces événements de phosphorylation des récepteurs entraînent souvent le recrutement de protéines adaptatrices et/ou de molécules de signalisation, qui se phosphorylent fréquemment elles-mêmes pour initier des cascades de kinases intracellulaires telles que la voie^mapk(e) de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) ^18,19.

Les effecteurs intracellulaires terminaux de ces cascades peuvent alors phosphoryler un ensemble de substrats, tels que les facteurs de transcription, la liaison à l’ARN, les protéines de matrice cytosquelettique et extracellulaire. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 ²⁵ et Sox9²⁶ font partie des facteurs de transcription phosphorylés dans le contexte du développement craniofacial. Cette modification post-traductionnelle (PTM) peut affecter directement la susceptibilité aux PTM alternatifs, la dimérisation, la stabilité, le clivage et/ou l’affinité de liaison à l’ADN, entre autres activités 20,21,25,26. De plus, la protéine de liaison à l’ARN Srsf3 est phosphorylée dans le contexte du développement craniofacial, ce qui conduit à sa translocation nucléaire²⁷. En général, il a été démontré que la phosphorylation des protéines de liaison à l’ARN affecte leur localisation subcellulaire, les interactions protéine-protéine, la liaison à l’ARN et / ou la spécificité de la séquence²⁸. En outre, la phosphorylation de l’actomyosine peut entraîner des réarrangements cytosquelettiques tout au long du développement craniofacial^29,30, et la phosphorylation des protéines de la matrice extracellulaire, telles que les petites glycoprotéines liées à l’azote du ligand liant l’intégrine, contribue à la biominéralisation au cours du développement du squelette³¹. À travers ce qui précède et de nombreux autres exemples, il est évident qu’il existe de vastes implications pour la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial. En ajoutant un niveau supplémentaire de régulation, la phosphorylation des protéines est encore modulée par les phosphatases, qui contrecarrent les kinases en éliminant les groupes phosphate.

Ces événements de phosphorylation aux niveaux du récepteur et de la molécule effectrice sont essentiels pour la propagation des voies de signalisation et entraînent finalement des changements dans l’expression des gènes dans le noyau, entraînant des activités cellulaires spécifiques, telles que la migration, la prolifération, la survie et la différenciation, qui entraînent une formation correcte du visage des mammifères. Compte tenu de la spécificité contextuelle des interactions protéiques avec les kinases et les phosphatases, des changements qui en résultent dans les PTM et de leurs effets sur l’activité cellulaire, il est essentiel que ces paramètres soient étudiés dans un cadre physiologiquement pertinent pour acquérir une compréhension complète de la contribution des événements de phosphorylation au développement craniofacial. Ici, des exemples de deux contextes dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines et, par conséquent, l’activation des voies de signalisation au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymes palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5 – à la fois primaires³² et immortalisées³³ . À E11.5, les processus maxillaires sont en train de fusionner avec les processus nasaux latéraux et médiaux¹, représentant ainsi un point temporel critique pendant le développement craniofacial de la souris. En outre, les processus maxillaires et les cellules dérivées des plateaux palataux ont été choisis ici parce que ces dernières structures sont des dérivés de la première, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité d’interroger la phosphorylation des protéines in vivo et in vitro dans des contextes connexes. Cependant, ce protocole est également applicable aux processus faciaux alternatifs et aux points temporels de développement.

Un problème critique dans l’étude des protéines phosphorylées est qu’elles sont facilement déphosphorylées lors de l’isolement des protéines par des phosphatases environnementales abondantes. Pour surmonter cette barrière, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des protéines phosphorylées sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des protéines phosphorylées. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses voies de signalisation actives au cours du développement craniofacial.