Экспериментальная вирусная инфекция у взрослых комаров при пероральном кормлении и микроинъекциях
Summary
Эта методология, которая включала пероральное кормление и инфекцию внутригрудных инъекций, могла эффективно оценить влияние барьеров средней кишки и/или слюнных желез на арбовирусную инфекцию.
Abstract
Вирусы, переносимые комарами (MBV), которые являются инфекционными патогенами для позвоночных, распространяются многими видами комаров, представляя серьезную угрозу для здоровья населения. После попадания в организм вирусы должны преодолеть барьер средней кишки комара, чтобы достичь гемолимфы, откуда они потенциально могут распространиться на слюнные железы. Когда комар кусает, эти вирусы распространяются на новых позвоночных хозяев. Точно так же комар может подхватывать разные вирусы. Как правило, только крошечная часть вирусов может проникать в слюнные железы через кишечник. На эффективность передачи этих вирусов в железы влияют два физических барьера, обнаруженных у разных видов комаров: барьеры средней кишки и барьеры слюнных желез. Этот протокол представляет собой метод обнаружения вируса в слюнных железах Aedes aegypti после перорального кормления и внутригрудной инъекционной инфекции. Кроме того, определение того, препятствуют ли кишки и/или слюнные железы распространению вируса, может помочь в оценке риска MBV, передаваемых Aedes aegypti.
Introduction
Переносимые комарами вирусы (MBV), гетерогенная группа РНК-вирусов, могут сохраняться в комарах-переносчиках и впоследствии распространяться на позвоночныххозяев1. Клинически значимые MBV в основном распространены в четырех семействах вирусов, а именно Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae и Peribunyavividae 2,3. В последние десятилетия эти вирусы были зарегистрированы по всему миру, вызывая проблемы общественного здравоохранения. Будучи одним из наиболее известных МБВ, вирус денге (DENV) стал наиболее распространенным возникающим или вновь возникающим арбовирусом в более чем 100 странах за последние 20 лет4. С момента обнаружения вируса Зика (ZIKV) внутри страны почти все тропические и субтропические страны и территории континента сообщили о случаях инфицирования людей вирусом ZIKV5. Чтобы оценить риск передачи вируса, многочисленные исследования в последние годы были сосредоточены на компетентности комаров-переносчиков этих вирусов 6,7. В связи с этим крайне важно эффективно предотвращать трансмиссивные болезни и бороться с ними.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), один из комаров, которых легче всего выращивать в лаборатории, является важным переносчиком DENV, ZIKV, вируса чикунгунья (CHIKV) и вируса желтой лихорадки (YFV)8. Долгое время Ae. aegypti был найден исключительно на африканском континенте и в Юго-Восточной Азии, но в последние годы он колонизировал почти все континенты9. Кроме того, глобальная численность Ae. aegypti постоянно растет, и, по оценкам, к концу столетия она увеличится на 20%10. В период с 2004 по 2009 гг. в Китае наблюдалось явное увеличение компетентности переносчиков Ae. aegypti для DENV из-за более высоких дневных температур11. Статус Ae. aegypti как патогенного переносчика значительно повысился в Китае. Следовательно, для решения этих проблем необходимо исследовать векторную способность Ae. aegypti передавать вирусы.
Как членистоногое-гематофаг, самка комара прокалывает кожу позвоночного хозяина и питается кровью. Комары иногда приобретают вирусы от инфицированных вирусом хозяев, а затем передают вирусы новому хозяину. Таким образом, для определения компетентности переносчиков комаров кормят искусственной кровяной мукой, содержащей арбовирусы, через систему кормления в лабораторных условиях12. Отдельные комары разделяются на головы, тела и выделения слюны через несколько дней после заражения. Для измерения вирусной инфекции, скорости распространения и передачи титры вируса были обнаружены с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) или анализа бляшек. Однако не у всех комаров развиваются инфекции средней кишки и способность передавать вирус следующему хозяину после кормления кровью. Это связано с физиологическими барьерами комаров, которые препятствуют проникновению патогенов в организм и играют жизненно важную роль в их врожденном иммунитете13. Барьеры средней кишки, особенно инфекционный барьер средней кишки (MIB) и барьер побега средней кишки (MEB), влияют на то, может ли вирус системно инфицировать вектора и эффективность, с которой он распространяется. Он препятствует анализу инфекции других тканей, таких как слюнные железы, которые также проявляют инфекцию слюнных желез и избегают барьеров13,14. Чтобы лучше охарактеризовать инфекцию средней кишки и слюнных желез у переносчика, здесь представлен подробный протокол перорального кормления и внутригрудной инокуляции арбовируса Ae. aegypti. Этот протокол может быть применен к дополнительным арбовирусным инфекциям у различных комаров-переносчиков, таких как инфекция DENV и ZIKV у Aedes spp., и может оказаться практически осуществимой процедурой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель этого метода состояла в том, чтобы обеспечить всестороннюю оценку риска одного вируса, переносимого комарами, путем оценки компетентности переносчиков посредством перорального кормления и внутригрудной инокуляции.
В эксперименте с пероральным кормлением набухши…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Уханьским проектом научно-технического плана (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Riferimenti
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
