Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie
Summary
Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.
Abstract
Door muggen overgedragen virussen (MBV’s), die infectieuze pathogenen zijn voor gewervelde dieren, worden door veel muggensoorten verspreid en vormen een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid. Eenmaal ingenomen, moeten de virussen de midgut-barrière van de mug overwinnen om de hemolymfe te bereiken, van waaruit ze zich mogelijk naar de speekselklieren kunnen verspreiden. Wanneer een mug bijt, worden deze virussen verspreid naar nieuwe gewervelde gastheren. Op dezelfde manier kan de mug verschillende virussen oppikken. Over het algemeen kan slechts een klein deel van de virussen via de darm de speekselklieren binnendringen. De transmissie-efficiëntie van deze virussen naar de klieren wordt beïnvloed door de twee fysieke barrières die worden aangetroffen in verschillende muggensoorten: midgutbarrières en speekselklierbarrières. Dit protocol presenteert een methode voor virusdetectie in speekselklieren van Aedes aegypti’s na orale voeding en intrathoracale injectie-infectie. Bovendien kan het bepalen of de darmen en/of speekselklieren de virale verspreiding belemmeren, helpen bij de risicobeoordelingen van MBV’s die door Aedes aegypti worden overgedragen.
Introduction
Door muggen overgedragen virussen (MBV’s), een heterogene groep RNA-virussen, kunnen blijven bestaan in muggenvectoren en zich vervolgens verspreiden naar gewervelde gastheren1. De klinisch belangrijke MBV’s zijn grotendeels verdeeld in vier virusfamilies, namelijk Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae en Peribunyavividae 2,3. In de afgelopen decennia zijn deze virussen over de hele wereld gemeld en veroorzaken ze problemen met de volksgezondheid. Als een van de meest bekende MBV’s is het Dengue-virus (DENV) de afgelopen 20 jaar het meest voorkomende opkomende of opnieuw opkomende arbovirus geworden in meer dan 100 landen4. Sinds de ontdekking van het Zika-virus (ZIKV) in het binnenland hebben bijna alle tropische en subtropische landen en gebieden van het continent menselijke ZIKV-infecties gemeld5. Om het risico op virusoverdracht te beoordelen, hebben talrijke studies in de afgelopen jaren zich gericht op de competentie van muggenvectoren voor deze virussen 6,7. Als gevolg hiervan is het van cruciaal belang om door vectoren overgedragen ziekten effectief te voorkomen en te beheersen.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), een van de gemakkelijkst te kweken muggen in het laboratorium, is een belangrijke vector van DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) en gelekoortsvirus (YFV)8. Lange tijd werd Ae. aegypti alleen gevonden op het Afrikaanse continent en in Zuidoost-Azië, maar in de afgelopen jaren heeft het bijna alle continenten gekoloniseerd9. Bovendien is de wereldwijde overvloed aan Ae. aegypti voortdurend gegroeid, met een geschatte toename van 20% tegen het einde van de eeuw10. Van 2004 tot 2009 was er in China een duidelijke toename van de Ae. aegypti-vectorcompetentie voor DENV als gevolg van hogere dag-tot-dagtemperaturen11. De status van Ae. aegypti als de pathogene vector is aanzienlijk gestegen in China. Om deze uitdagingen aan te pakken, is het daarom noodzakelijk om de vectorcompetentie van Ae. aegypti’s om virussen over te brengen te onderzoeken.
Als een hematofaag geleedpotige doorboort de vrouwelijke mug de huid van een gewervelde gastheer en voedt zich met het bloed. Muggen krijgen af en toe virussen van met virussen geïnfecteerde gastheren en brengen de virussen vervolgens over naar een nieuwe gastheer. Om de vectorcompetentie te bepalen, krijgen muggen een kunstmatig bloedmeel met arbovirussen toegediend via een voedingssysteem in de laboratoriumomgeving12. Individuele muggen worden enkele dagen na infectie gescheiden in hoofden, lichamen en speekselafscheidingen. Om virusinfectie, verspreiding en transmissiesnelheden te meten, zijn virustiters gedetecteerd door kwantitatieve reverse-transcription PCR (qRT-PCR) of plaque-assay. Niet alle muggen ontwikkelen echter midgut-infecties en het vermogen om een virus over te brengen naar de volgende gastheer na bloedvoeding. Het is gekoppeld aan de fysiologische barrières van muggen, die voorkomen dat ziekteverwekkers het lichaam binnendringen en een vitale rol spelen in hun aangeboren immuniteit13. De midgutbarrières, met name de midgut-infectiebarrière (MIB) en midgut-ontsnappingsbarrière (MEB), beïnvloeden of het virus de vector systemisch kan infecteren en de efficiëntie waarmee het zich verspreidt. Het belemmert de analyse van de infectie van andere weefsels, zoals speekselklieren die ook speekselklierinfectie vertonen en aan barrières ontsnappen13,14. Om de infectie van midguts en speekselklieren in de vector beter te karakteriseren, wordt hierin een gedetailleerd protocol voor orale voeding en intrathoracale inenting van arbovirus in Ae. aegypti gepresenteerd. Dit protocol kan worden toegepast op aanvullende arbovirusinfecties in verschillende muggenvectoren, zoals DENV- en ZIKV-infectie in Aedes spp., en kan een praktische procedure blijken te zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze methode was om een uitgebreide risicobeoordeling van één door muggen overgedragen virus te bieden door vectorcompetentie te evalueren door orale voeding en intrathoracale inenting.
In het orale voedingsexperiment moeten opgezwollen muggen worden uitgezocht en overgebracht naar een nieuwe container, wat een ernstig risico vormt voor de operators. De reden hiervoor is dat elke mug, inclusief niet-geïnfecteerde muggen, een bron van infectie kan zijn19….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Riferimenti
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
