使用冻热裂解和同量异位载体进行质谱分析的单细胞蛋白质组学制备

注意：在此协议中，室温（RT）为18-22°C。 1. 载体和参考物质生成 细胞分离将感兴趣的细胞收集到冰冷的1x PBS中的细胞悬浮液中。注意：如果可能，载体和参考物质应从选择在单细胞水平上研究的细胞群中制备。来自不同实验条件的相似数量的细胞（如受刺激和未受刺激的免疫细胞）应构成载体和参考。在无法收获足够数量的这些细胞的情况下，应根据生物学相似性选择合适的细胞群。 使用血细胞计数器或其他细胞计数方法（如FACS），计数悬浮液中的细胞数量。 将每种细胞类型的 22，000 个细胞分别旋转并重悬于 11 μL HPLC 级水中，分别放入 PCR 管（标准 250 μL PCR 管）中。注意：此处建议的细胞数量对于载体和参考文献来说足以满足可以从充满单细胞的384孔板制备的组数。此步骤中的细胞输入和后续步骤中的试剂量可以按比例缩放，以获得更多的组数。旋转的速度取决于实验室的细胞培养实践。典型的旋转下降：300 × g 5 分钟。 将样品转移到-80°C冰箱中至少30分钟。暂停点：样品可以保持冷冻数月，对单细胞数据没有影响。 细胞裂解将带有细胞的PCR管加热至90°C10分钟（热循环仪盖设置为105°C），然后在加热循环后立即让管冷却至12°C。 短暂涡旋试管，然后在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转，以收集管底部的所有液体。 在水浴超声仪中，将试管超声处理5分钟，然后将它们放在室温的冰上。 胰蛋白酶消化在冰上向每个样品管中加入 2.2 μL 预混液（组分见 表 1 ）。注意：胰蛋白酶会引起皮肤、呼吸道和眼睛刺激。请务必穿戴个人防护装备。在化学通风橱下处理。 短暂涡旋试管以混合并在室温的台式PCR管旋转器中旋转，以收集每个试管底部的所有液体。 将样品在37°C下加热3小时（热循环仪盖设置为52°C）。 TMT标记反应在室温下在台式PCR管旋转器中消化后旋转样品。 将每个样品分成两个相等体积，每个体积为 6.6 μL，使每个试管包含 11，000 个细胞。 向用于载体的管中，加入 3.3 μL TMT 标记物 126，该标记物已以 85 mM 的浓度重悬。 向用于参考的试管中加入 3.3 μL TMT 标记物 127N，该标记物已以 85 mM 的浓度重悬。 短暂涡旋试管并在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转以收集底部的液体。 将试管在室温下放置1小时。 TMT标记反应的淬灭向每个试管中加入 1.65 μL 0.5% 羟胺。注意：羟胺会引起皮肤刺激。请务必穿戴个人防护装备。 短暂涡旋试管并在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转以收集底部的液体。 将试管在室温下放置30分钟。 载波和参考的组合如果构成载体的样品已单独标记，请以相等的比例混合。 如果构成参比的样品已单独标记，请以相等的比例混合它们。 混合载体和参比物，使载体的终浓度为100-200个细胞/μL，参比浓度为5-10个细胞/μL。 在将载体和参考材料与单细胞组组合之前，评估载体和参考材料的质量。注意：载体和参考物质的质量控制可以通过多种方法进行，但建议使用DO-MS软件，该软件可在do-ms.slavovlab.net 17中找到。质量的关键测量值包括错裂率（99%，该指标计算为标记位点的数量，即肽N末端和赖氨酸，标记除以标记位点总数）。暂停点：载体和参考物质可以储存在-80°C，直到需要为止。 元件 混合浓度 每管最终浓度 胰蛋白酶金 50 纳克/微升 8.33 纳克/微升 钛，pH = 8.5 500 毫米 83.33 毫米 苄佐酶核酸酶 1.2 单位 0.2 单位 表1：预混液的试剂量。 列出了胰蛋白酶消化所需的试剂的最终浓度。 2. SCoPE2样品制备 细胞分离每μL合成肽溶液中每肽补充25 fmol的HPLC级水。注意：沃特世MassPrep肽溶液是可以使用的一个例子。它由七种不能很好地电离的肽组成。这是该解决方案的一个关键方面：这些肽不会干扰单细胞的准确质谱定量。任何不太可能在目标样品中的几种肽的高度纯化混合物都是合适的。 使用液体分配机器人或手动移液器向 384 孔板的每个孔中加入 1 μL 该混合物。 密封板并在室温的台式板旋转器中旋转，以收集底部的液体。暂停点：带有该溶液的板可以储存在-80°C，直到需要为止。 获得解聚的未固定细胞的悬浮液。注意：如何准确获得细胞悬液取决于感兴趣的细胞类型。以下是广泛的示例：悬浮细胞：将细胞旋转成沉淀，并除去细胞培养基。 贴壁细胞：通过胰蛋白酶消化或刮擦从培养皿或烧瓶中取出细胞。然后，旋转它们以除去细胞培养基。 用1x冰冷的PBS清洗细胞悬液两次。第二次洗涤后，将细胞悬浮在1x PBS中。 如果384孔板被冷冻，请在室温下解冻。 旋转以确保所有液体都在孔底部。 使用细胞分选仪或其他可用方法（例如手动手动拾取）将单个细胞分配到相应的孔中。注意：将单个细胞添加到孔中，同时将一些孔留空以进行阴性和阳性对照（请参阅讨论）。使用流式细胞术时，应使用尽可能低的流式速进行流式细胞仪。较低的流速被认为对细胞处理更温和。此外，喷嘴尺寸应适合与感兴趣的细胞一起使用。建议与流式细胞术设施合作。 将 2-5 个细胞当量裂解物的阳性对照添加到手动移液或使用液体处理机器人移液的选定孔中。 在室温的台式板旋转器中用分选的细胞密封并旋转板，以收集底部的液体。尽快将板冷冻在-80°C。暂停点：带有分选单细胞的板可以储存在-80°C，直到需要为止。 细胞裂解取带有分选单细胞的384孔板，并尽快将其放入热循环仪中。 将板加热至90°C10分钟（盖子温度设置为105°C），然后让板冷却至12°C。 在室温下在台式板旋转器中短暂旋转板。 在水浴超声仪中，在室温下超声处理板5分钟，然后将其放在冰上。 胰蛋白酶消化每 384 孔板准备 100 μL 预混液（组分见 表 1 ）。 向 384 孔板的每个孔中，使用液体处理器加入 0.2 μL 在步骤 2.3.1 中制备的预混液。注意：如果使用手动移液，请使用更大的体积，确保每孔试剂的最终浓度仍然相同。 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。 将384孔板在37°C（盖子温度设置为52°C）下加热3小时。 TMT标记反应从-80°C冰箱中取出85 mM的TMT标签（128N至135N）库存。在打开试管之前将试管加热至室温。 将标记物在无水乙腈中稀释至22mM。注意：乙腈是一种易燃液体。它会刺激皮肤、眼睛、呼吸道和中枢神经系统。请务必穿戴个人防护装备。在化学通风橱下处理。 使用此标记策略，向 384 孔板的每个孔中加入 0.5 μL 稀释的 TMT 标记。使用液体分配机器人（如果使用液体处理器，请确保使用适用于有机溶剂的相关设备）或手动移液器。注意：有关标记策略，请参阅 表 2 。有关板布局示例，请参见 表 3 。 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。 让标记反应在室温下进行1小时。 TMT标记反应的淬灭向 384 孔板的每个孔中，使用液体处理器加入 0.2 μL 0.5% 羟胺（在 HPLC 级水中稀释）。注意：如果使用手动移液，请使用更大的体积，确保每孔试剂的最终浓度仍然相同。 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。 将板保持在室温下30分钟。 LC-MS/MS分析的制备：将单细胞和对照孔与载体/参考物质相结合从-80°C冰箱中取出组合的载体/参考物质。 对于每组，将 1 μL 载体和参考物质移液到将成为单组一部分的第一孔中。将第一口井的全部体积移液到后续孔中。继续将整个体积从一个细胞移液到下一个细胞，直到要包含在一组中的所有孔都合并到最终孔中。注意：载体和参考物质的浓度应分别为200和5细胞当量，但如前所述21，这些量可能会有所不同。如标记策略（见 表2）所述，当使用TMTpro-16plex或TMTpro-18plex时，每组应分别包含载体、参比和最多12或14个单细胞或对照样品（参见步骤2.4.3）。 对于每组，向每组中包含的第一个单细胞孔中加入 5 μL 50% 乙腈（用 HPLC 级水稀释）。将整个体积从第一个孔移液到下一个孔。继续将整个体积从一个细胞移液到下一个细胞，直到要包含在一组中的所有孔都合并到最终孔中。注意：该洗涤步骤有助于从孔中回收样品。 将每组转移到各自的自动进样器玻璃插件中。注意：这些套件也可以组合成384孔板的单孔，并直接放置在自动进样器中进行进样28。 将所有组组合并放入玻璃插入物中后，干燥样品。暂停点：干燥的套装可以在-80°C下储存至少1周，然后再在质谱仪上运行。 在进行LC-MS/MS分析之前，向每组添加1.2 μL 0.1%甲酸（用HPLC级水稀释），以重悬标记的肽。注意：甲酸是一种易燃液体。它可能导致严重的眼睛损伤或皮肤灼伤。请务必穿戴个人防护装备。在通风良好的地方处理。 将自动进样器插入物放入玻璃自动进样器小瓶中，并用盖子关闭每个样品。 涡旋每个小瓶5秒以确保重悬完成，然后在室温下在小瓶旋转器中旋转。 确保每个样品都在插入物的底部，而不是溅在侧面。 将样品瓶放入自动进样器托盘中。 对于每组，进样 1 μL 进行 LC-MS/MS 分析。 标签 126 127N 127C 128N 128摄氏度 129N 129摄氏度 130N 130摄氏度 …. 135N 样品类型 载体 参考 空 空 SC/控制 SC/控制 SC/控制 SC/控制 SC/控制 …. SC/控制 表 2：SCoPE2 TMTpro-18plex 标记方案示例。 载波和参考通常在前两个TMT标签中标记。然后，由于潜在的同位素污染，接下来的两个标记被跳过，这将使定量准确性降低。剩下的其他标签用于单个单元格或控件。 128摄氏度 129N 129摄氏度 130N 130摄氏度 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N 128摄氏度 129N 129摄氏度 130N 130摄氏度 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 一个 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 B 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + C 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – D 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 E 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 F 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 G 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 H 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 我 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 J – 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 K 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 – – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 L 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 M 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 N + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 O 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 P 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 + 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 南卡罗来纳州 – 南卡罗来纳州 表 3：使用 TMTpro-16plex 标记的印版布局示例。 使用384孔板格式（或任何其他板格式），随机化细胞分选的孔很重要。TMTpro-18plex将使用不同的板布局。