Análise por Citometria de Fluxo de Biomarcadores para Detecção de Defeitos Funcionais do Espermatozoide Humano
Summary
O presente protocolo fornece uma solução prática que permite a medição de apoptose, potencial de membrana mitocondrial e danos ao DNA em espermatozoides humanos com um único citômetro.
Abstract
A análise convencional de parâmetros seminais é amplamente utilizada para avaliar a fertilidade masculina. No entanto, estudos descobriram que ~15% das pacientes inférteis não apresentam anormalidades nos parâmetros do sêmen convencional. Tecnologias adicionais são necessárias para explicar a infertilidade idiopática e detectar defeitos sutis do esperma. Atualmente, biomarcadores da função espermática, incluindo apoptose espermática, potencial de membrana mitocondrial (MMP) e danos ao DNA, revelam a fisiologia espermática em nível molecular e são capazes de predizer a fertilidade masculina.
Com técnicas de citometria de fluxo (FCM), cada um desses marcadores pode ser medido de forma rápida, precisa e precisa em amostras de sêmen humano, mas os custos de tempo aumentam substancialmente e os resultados podem ser obstruídos se todos os biomarcadores precisarem ser testados com um único citômetro. Neste protocolo, após a coleta e incubação imediata a 37 °C para liquefação, amostras de sêmen foram posteriormente analisadas para apoptose espermática usando a coloração de isotiocianato de fluoresceína Anexina V (FITC)/iodeto de propídio (PI). A MMP foi marcada com sonda de 5,5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilcarbocianina iodeto (JC-1), e os danos ao DNA foram avaliados usando o ensaio de estrutura da cromatina espermática (SCSA) com coloração de laranja de acridina (AO). Assim, a análise por citometria de fluxo de marcadores de função espermática pode ser uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico de infertilidade e avaliação da função espermática tanto na bancada quanto no leito.
Introduction
A infertilidade tornou-se um problema de saúde pública, sendo que a infertilidade masculina contribui com 40%-50% de todos os casos 1,2. Embora a análise convencional da qualidade do sêmen desempenhe um papel importante na determinação do potencial de fertilidade masculina, aproximadamente 15% das pacientes com infertilidade apresentam parâmetros espermáticos normais, como contagem de espermatozoides, motilidade e morfologia3. Além disso, os exames de rotina do esperma têm pouca repetibilidade, fornecem informações limitadas sobre a função espermática e não podem fornecer uma avaliação precisa da fertilidade masculina ou refletir os defeitos sutis dos espermatozoides. Várias técnicas foram desenvolvidas para testar a função espermática, como o ensaio de hemizona (HZA), o ensaio de penetração espermática, o teste de inchaço hipo-osmótico, o teste de anticorpos antiespermatozoides, mas esses métodos são demorados e vulneráveis a influências subjetivas dos operadores. Portanto, é necessário desenvolver métodos rápidos e precisos para análise da função espermática.
A FCM é uma tecnologia de análise rápida e unicelular desenvolvida na década de 1970, que tem sido amplamente utilizada em vários campos da biologia celular e da medicina. A MCF é uma ferramenta robusta para a avaliação da função espermática que analisa espermatozoides marcados com sonda de fluorescência específica4. Os espermatozoides passam através de lasers de canal único ou multicanal, e a luz espalhada e a fluorescência emitida são produzidas por um feixe de laser. A luz espalhada inclui luz espalhada direta (FSC) e luz espalhada lateral (SSC), que reflete o tamanho da célula testada e a granularidade ou estrutura interna da célula. Esses sinais são coletados, exibidos e analisados pelo sistema computacional e, consequentemente, uma série de características dos espermatozoides são medidas de forma rápida e precisa. Portanto, o FCM é uma técnica rápida, objetiva, multidimensional e de alto rendimento que tem ganhado cada vez mais atenção no campo da análise espermática. A aplicação do FCM pode compensar deficiências nos métodos tradicionais e fornece uma nova abordagem para a detecção da estrutura e função interna dos espermatozoides.
A apoptose espermática está intimamente relacionada à fertilidade masculina5. A detecção de apoptose espermática é um índice importante para avaliar a função espermática em nível molecular. O FCM é amplamente reconhecido como um método confiável e sensível para detectar a apoptose espermática usando a coloração Annexin V-FITC/PI. O princípio básico é que a fosfatidilserina (PS) é transferida da camada interna da membrana celular para sua camada externa no estágio inicial da apoptose. A anexina V é uma proteína fosfolipídica Ca2+ dependente (geralmente marcada por FITC) que tem alta afinidade pelo SP, detectando, assim, o SF exposto à superfície externa da membrana celular6. Necrose e apoptose podem ser distinguidas em combinação com coloração de Pl. Portanto, o método de dupla coloração da anexina V-FITC/PI é amplamente utilizado, pois é rápido, simples e fácil de detectar diferentes espermatozoides apoptóticos.
Um espermatozoide maduro de mamíferos contém aproximadamente 72-80 mitocôndrias7, sugerindo uma razão biológica para a retenção de espermatozoides mitocôndrias8. Descobriu-se que as mitocôndrias espermáticas desempenham papéis importantes na manutenção da motilidade e fertilidade espermáticas9. A coloração JC-1, que pode ser usada como indicador de MMP em uma variedade de tipos celulares, é um dos fluorocromos mais populares para avaliação da atividade mitocondrial espermática10. JC-1 é um corante catiônico que se acumula potencial-dependente nas mitocôndrias. O JC-1 tem uma emissão máxima de fluorescência em 525 nm (verde) e forma agregados J 11 quando se liga a membranas com alto potencial (ΔΨm, 80-100 mV), resultando em um deslocamento na emissão de fluorescência para ~590 nm (laranja-vermelho). Consequentemente, a despolarização mitocondrial espermática é indicada por uma diminuição na razão de intensidade de fluorescência vermelho/verde, e FCM pode ser usado para detectar os níveis de MMP em amostras de sêmen humano.
A metodologia SCSA foi inventada por Evenson et al.12, sendo considerada um teste preciso e repetível com dados únicos de dois parâmetros (fluorescência vermelha vs verde) em uma escala de 1.024 × 1.024canais13. Em espermatozoides danificados, o DNA e as proteínas alteradas nos núcleos dos espermatozoides são marcados por AO, e as quebras da fita de DNA são medidas por fluorescência vermelha, enquanto fitas duplas intactas emitem fluorescência verde no FCM14. Atualmente, muitos métodos têm sido desenvolvidos para estimar a integridade do DNA espermático. No entanto, ao contrário da SCSA, esses ensaios são frequentemente trabalhosos e não têm a capacidade de um diagnóstico de infertilidade masculina. Os resultados do teste SCSA correlacionam-se significativamente com gravidez e aborto espontâneo do DNA humano, fornecem evidências convincentes de que a SCSA pode ser útil na análise de sêmen humano e pode servir como uma ferramenta valiosa para os clínicos de infertilidade15.
A integridade da cromatina, a MMP e a apoptose refletem diferentes aspectos da função espermática e, portanto, a combinação desses biomarcadores pode fornecer uma visão mais abrangente sobre o status do espermatozoide. O FCM pode ser usado para medições separadas de integridade da cromatina, MMP ou apoptose em amostras de sêmen humano. Embora o custo da FCM e o custo dos corantes tenham limitado a ampla aplicação dessas técnicas em laboratórios clínicos de saúde reprodutiva, seu valor para estimativa da fecundidade está sendo aceito.
No entanto, como cada um dos experimentos requer pré-tratamento de amostras de espermatozoides, e todas as amostras pré-tratadas precisam ser testadas o mais rápido possível, a medição simultânea de todos os três biomarcadores para uma amostra com um único FCM pode levar a um longo tempo de espera para alguns dos experimentos e obstruir a confiabilidade dos resultados. Isso ocorre porque os espermatozoides recebem danos adicionais durante o processo de espera, se o protocolo não for organizado adequadamente levando todos os três experimentos inteiramente em consideração. Este trabalho apresenta um protocolo que realiza a mensuração fluente de todos os três biomarcadores em uma única citometria sem comprometer substancialmente a qualidade do experimento induzida por tempos de espera prolongados.
Protocol
Representative Results
Discussion
A integridade da cromatina, a MMP e a apoptose dos espermatozoides humanos têm se mostrado preditores valiosos de desfechos reprodutivos. O último manual laboratorial da OMS para o exame e processamento de sêmen humano (sexta edição) também destacou alguns desses indicadores (integridade da cromatina e apoptose) como exames estendidos além do exame básico de parâmetros de rotina, como a contagem de espermatozoides18. Publicações recentes também sugerem que esses indicadores podem ser marcadores mais sensíveis de resposta a exposições externas perigosas, indicando seu potencial para a identificação de danos reprodutivos em um estágio mais precoce19,20. A combinação desses indicadores com exames de rotina também pode proporcionar uma compreensão mais abrangente sobre o perfil de disfunção espermática e a complexidade dos danos reprodutivos masculinos na população.
Existem várias questões-chave que determinam substancialmente o sucesso da análise espermática com FCM. Primeiro, a dosagem de MMP e apoptose espermática requer exame imediato após a liquefeito do sêmen. Para minimizar o custo do tempo, dois técnicos podem se encarregar separadamente do pré-tratamento de MMP e da análise de apoptose de uma amostra. Como o pré-tratamento da apoptose é mais simples, ela seria transferida para a etapa de citometria de fluxo mais rapidamente do que a análise de MMP. Para a análise SCSA, as amostras de sêmen fresco devem ser criopreservadas imediatamente após a disponibilidade após a liquefação. As amostras de esperma podem então ser armazenadas em nitrogênio líquido por um período relativamente longo e não precisam de exame imediato.
Assim, o custo do tempo no local do experimento pode ser comprimido para 40 min, que é a duração da análise de MMP mais a etapa de citometria de fluxo da análise espermática. Em segundo lugar, a configuração do confinamento na plataforma de citometria de fluxo deve ser decidida para cada lote de amostras separadamente. As amostras de espermatozoides com subgrupos de células claras no gráfico de dispersão podem ser selecionadas como referência para desenhar a área de confinamento. Em terceiro lugar, como não há valores de referência clínica amplamente aceitos para os indicadores deste experimento, os resultados históricos podem ser usados como uma importante ferramenta para o controle de qualidade. Controles positivos e negativos também são encorajados a serem estabelecidos em cada lote de medições, especialmente para SCSA e MMP.
Os resultados representativos da análise espermática fornecidos aqui são derivados usando um Accuri C6. No entanto, a técnica poderia ser aplicada a outras plataformas comerciais com pequenas modificações. Normalmente, um total de 5 × 106 espermatozoides seriam necessários para atender ao requisito para a medição de todos os indicadores. Se a concentração espermática de uma amostra for muito menor do que o nível médio, a necessidade do volume de sêmen aumentaria.
Semelhante aos parâmetros espermográficos de rotina, também é notável variação intraindividual na integridade da cromatina, MMP e apoptose dos espermatozoides humanos21. Assim, múltiplos testes de amostras coletadas em momentos diferentes podem fornecer uma estimativa mais precisa do nível de dano à função espermática. Embora não haja um período recomendado de abstinência antes da coleta de espermatozoides para a análise por citometria de fluxo, 2-7 dias de abstinência ejaculatória, sugeridos para análise espermática de rotina pela OMS, podem ser adotados. Pode ajudar a melhorar a comparabilidade dos resultados entre laboratórios e entre diferentes amostras coletadas dos mesmos homens.
Uma grande limitação deste método é que dois dos três biomarcadores testados – a apoptose e o potencial de membrana mitocondrial – requerem amostras de sêmen fresco. Isso pode limitar sua aplicação a homens que podem fornecer amostras de sêmen para o laboratório. Para o teste de danos ao DNA (SCSA), amostras de referência devem ser preparadas antes do experimento para calibrar o citômetro de fluxo. Vale ressaltar que a aplicação do presente protocolo requer um instrumento de FCM no laboratório, o que ainda é um desafio considerável para muitos laboratórios clínicos, embora a cooperação com um serviço terceirizado possa ser uma opção alternativa em algumas regiões.
Além disso, o gasto com os corantes e outros reagentes também é um fator financeiro para os machos que podem precisar do exame. Por fim, o protocolo pode precisar de modificação se diferentes marcas ou versões do FCM forem usadas para examinar os biomarcadores. Em resumo, este trabalho apresenta uma abordagem prática para estimar três biomarcadores de danos aos espermatozoides humanos por uma única máquina de citometria de fluxo. Isso pode fornecer informações valiosas sobre a saúde reprodutiva masculina e complementar o exame de rotina de espermatozoides.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os trabalhadores de campo pela ajuda e aos entrevistados pela colaboração.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
Riferimenti
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