Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien
Summary
Das vorliegende Protokoll bietet eine praktische Lösung, die die Messung von Apoptose, mitochondrialem Membranpotenzial und DNA-Schäden in menschlichen Spermien mit einem einzigen Zytometer ermöglicht.
Abstract
Die konventionelle Samenparameteranalyse wird häufig zur Beurteilung der männlichen Fruchtbarkeit eingesetzt. Studien haben jedoch ergeben, dass ~15% der unfruchtbaren Patientinnen keine Anomalien in den konventionellen Samenparametern aufweisen. Es werden zusätzliche Technologien benötigt, um die idiopathische Unfruchtbarkeit zu erklären und subtile Spermiendefekte zu erkennen. Derzeit zeigen Biomarker der Spermienfunktion, einschließlich der Apoptose der Spermien, des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP) und der DNA-Schäden, die Spermienphysiologie auf molekularer Ebene und sind in der Lage, die männliche Fruchtbarkeit vorherzusagen.
Mit Durchflusszytometrie-Techniken (FCM) kann jeder dieser Marker schnell, genau und präzise in menschlichen Samenproben gemessen werden, aber der Zeitaufwand steigt erheblich und die Ergebnisse könnten behindert werden, wenn alle Biomarker mit einem einzigen Zytometer getestet werden müssen. In diesem Protokoll wurden die Samenproben nach der Entnahme und sofortigen Inkubation bei 37 °C zur Verflüssigung mittels Annexin-V-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI)-Färbung weiter auf Spermienapoptose analysiert. Das MMP wurde mit einer 5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyaniniodid (JC-1)-Sonde markiert, und der DNA-Schaden wurde mit dem Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA) mit Acridinorange (AO)-Färbung bewertet. Daher kann die durchflusszytometrische Analyse von Spermienfunktionsmarkern ein praktisches und zuverlässiges Instrumentarium für die Diagnose von Unfruchtbarkeit und die Beurteilung der Spermienfunktion sowohl auf der Bank als auch im Bett sein.
Introduction
Unfruchtbarkeit ist zu einem Problem der öffentlichen Gesundheit geworden, wobei männliche Unfruchtbarkeit 40%-50% aller Fälle ausmacht 1,2. Obwohl die konventionelle Samenqualitätsanalyse eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des männlichen Fertilitätspotenzials spielt, weisen etwa 15 % der Patientinnen mit Unfruchtbarkeit normale Spermienparameter wie Spermienzahl, Beweglichkeit und Morphologie auf3. Darüber hinaus haben routinemäßige Spermienuntersuchungen eine schlechte Wiederholbarkeit, liefern nur begrenzte Informationen über die Spermienfunktion und können keine genaue Bewertung der männlichen Fruchtbarkeit geben oder die subtilen Defekte der Spermien widerspiegeln. Es wurden mehrere Techniken entwickelt, um die Spermienfunktion zu testen, wie z. B. der Hemizona-Assay (HZA), der Spermienpenetrationstest, der hypoosmotische Schwellungstest, der Anti-Spermien-Antikörpertest, aber diese Methoden sind zeitaufwändig und anfällig für subjektive Einflüsse der Betreiber. Daher ist es notwendig, schnelle und genaue Methoden für die Analyse der Spermienfunktion zu entwickeln.
FCM ist eine in den 1970er Jahren entwickelte schnelle Einzelzellanalysetechnologie, die in verschiedenen Bereichen der Zellbiologie und Medizin weit verbreitet ist. FCM ist ein robustes Werkzeug zur Bewertung der Spermienfunktion, das Spermien analysiert, die mit einer spezifischen Fluoreszenzsonde markiert sind4. Die Spermien durchlaufen Ein- oder Mehrkanallaser, wobei Streulicht und emittierte Fluoreszenz durch einen Laserstrahl erzeugt werden. Das Streulicht umfasst vorwärts gestreutes Licht (FSC) und seitliches Streulicht (SSC), das die Größe der getesteten Zelle und die Zellgranularität oder innere Struktur widerspiegelt. Diese Signale werden vom Computersystem gesammelt, angezeigt und analysiert, und folglich werden eine Reihe von Merkmalen der Spermien schnell und genau gemessen. Daher ist die FCM eine schnelle, objektive, mehrdimensionale Technik mit hohem Durchsatz, die im Bereich der Spermienanalyse zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen hat. Die Anwendung von FCM kann Mängel herkömmlicher Methoden ausgleichen und bietet einen neuen Ansatz für die Erkennung der inneren Struktur und Funktion von Spermien.
Die Apoptose der Spermien steht in engem Zusammenhang mit der männlichen Fruchtbarkeit5. Der Nachweis der Apoptose von Spermien ist ein wichtiger Index zur Bewertung der Spermienfunktion auf molekularer Ebene. FCM ist weithin als zuverlässige und empfindliche Methode zum Nachweis der Apoptose von Spermien mittels Annexin V-FITC/PI-Färbung anerkannt. Das Grundprinzip besteht darin, dass Phosphatidylserin (PS) im frühen Stadium der Apoptose von der inneren Schicht der Zellmembran auf ihre äußere Schicht übertragen wird. Annexin V ist einCa2+-abhängiges Phospholipidprotein (normalerweise durch FITC markiert), das eine hohe Affinität für PS aufweist und somit PS detektiert, das der äußeren Oberfläche der Zellmembran ausgesetztist 6. Nekrose und Apoptose können in Kombination mit Pl-Färbung unterschieden werden. Daher ist die Methode der Annexin V-FITC/PI-Doppelfärbung weit verbreitet, da sie schnell, einfach und leicht ist, verschiedene apoptotische Samenzellen nachzuweisen.
Ein reifes Säugetierspermium enthält etwa 72-80 Mitochondrien7, was auf einen biologischen Grund für die Retention von Spermienmitochondrienhindeutet 8. Es wurde festgestellt, dass die Mitochondrien der Spermien eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Beweglichkeit und Fruchtbarkeit der Spermien spielen9. Die JC-1-Färbung, die als Indikator für MMP in einer Vielzahl von Zelltypen verwendet werden kann, ist eines der beliebtesten Fluorochrome zur Beurteilung der Mitochondrienaktivität von Spermien10. JC-1 ist ein kationischer Farbstoff, der sich potentialabhängig in den Mitochondrien anreichert. JC-1 hat eine maximale Fluoreszenzemission bei 525 nm (grün) und bildet J-Aggregate 11, wenn es an Membranen mit hohem Potential (ΔΨm, 80-100 mV) bindet, was zu einer Verschiebung der Fluoreszenzemission auf ~590 nm (orange-rot) führt. Folglich wird die mitochondriale Depolarisation der Spermien durch eine Abnahme des rot/grünen Fluoreszenzintensitätsverhältnisses angezeigt, und FCM kann verwendet werden, um MMP-Spiegel in menschlichen Samenproben nachzuweisen.
Die SCSA-Methodik wurde von Evenson et al.12 erfunden und gilt als präziser und wiederholbarer Test mit einzigartigen Dual-Parameter-Daten (rote vs. grüne Fluoreszenz) auf einer 1.024 × 1.024 Kanalskala13. In geschädigten Spermien werden DNA und veränderte Proteine in Spermienkernen durch AO markiert, und Brüche des DNA-Strangs werden durch rote Fluoreszenz gemessen, während intakte Doppelstränge grüne Fluoreszenz in FCM14 emittieren. Heutzutage wurden viele Methoden entwickelt, um die Integrität der Spermien-DNA abzuschätzen. Im Gegensatz zu SCSA sind diese Assays jedoch oft arbeitsintensiv und nicht in der Lage, eine männliche Unfruchtbarkeit zu diagnostizieren. Die Ergebnisse des SCSA-Tests korrelieren signifikant mit der Schwangerschaft und Fehlgeburt der menschlichen DNA, liefern überzeugende Beweise dafür, dass SCSA bei der Analyse von menschlichem Sperma nützlich sein kann, und können als wertvolles Werkzeug für Unfruchtbarkeitskliniker dienen15.
Chromatinintegrität, MMP und Apoptose spiegeln unterschiedliche Aspekte der Spermienfunktion wider, so dass die Kombination dieser Biomarker einen umfassenderen Einblick in den Spermienstatus geben kann. FCM kann für separate Messungen der Chromatinintegrität, des MMP oder der Apoptose in menschlichen Samenproben verwendet werden. Obwohl die Kosten für FCM und Farbstoffe die breite Anwendung dieser Techniken in klinischen Labors für die reproduktive Gesundheit eingeschränkt haben, wird ihr Wert für die Schätzung der Fruchtbarkeit akzeptiert.
Da jedoch jedes der Experimente eine Vorbehandlung der Spermienproben erfordert und alle vorbehandelten Proben so schnell wie möglich getestet werden müssen, kann die gleichzeitige Messung aller drei Biomarker für eine Probe mit einem einzigen FCM zu einer langen Wartezeit für einige der Experimente führen und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Dies liegt daran, dass die Spermien während des Warteprozesses zusätzlichen Schaden erleiden, wenn das Protokoll nicht unter Berücksichtigung aller drei Experimente richtig angeordnet ist. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, das die fließende Messung aller drei Biomarker in einer einzigen Zytometrie ermöglicht, ohne die Experimentqualität durch längere Wartezeiten wesentlich zu beeinträchtigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chromatinintegrität, MMP und Apoptose menschlicher Spermien haben sich als wertvolle Prädiktoren für Fortpflanzungsergebnisse erwiesen. Auch im zuletzt veröffentlichten WHO-Laborhandbuch für die Untersuchung und Verarbeitung von menschlichem Sperma (sechste Auflage) wurden einige dieser Indikatoren (Chromatinintegrität und Apoptose) als erweiterte Untersuchungen hervorgehoben, die über die grundlegende Untersuchung von Routineparametern wie der Spermienzahl hinausgehen18. Jüngste Veröffentlichungen deuten auch darauf hin, dass diese Indikatoren empfindlichere Marker für die Reaktion auf externe gefährliche Expositionen sein könnten, was auf ihr Potenzial für die Identifizierung von Fortpflanzungsschäden in einem früheren Stadium hinweist19,20. Die Kombination dieser Indikatoren mit Routineuntersuchungen kann auch ein umfassenderes Verständnis des Profils der Spermiendysfunktion und der Komplexität der männlichen Fortpflanzungsschäden in der Bevölkerung liefern.
Es gibt mehrere Schlüsselfaktoren, die den Erfolg der Spermienanalyse mit FCM maßgeblich bestimmen. Zunächst erfordert die Messung von MMP und Apoptose der Spermien eine sofortige Untersuchung nach der Verflüssigung des Samens. Um den Zeitaufwand zu minimieren, können zwei Techniker die Vorbehandlung von MMP und die Apoptoseanalyse einer Probe separat übernehmen. Da die Vorbehandlung der Apoptose einfacher ist, würde sie schneller in den durchflusszytometrischen Schritt übergehen als die MMP-Analyse. Für die SCSA-Analyse sollten frische Samenproben sofort nach Verfügbarkeit nach der Verflüssigung kryokonserviert werden. Die Samenproben können dann relativ lange in flüssigem Stickstoff gelagert werden und müssen nicht sofort untersucht werden.
Dementsprechend kann der Zeitaufwand des Experiments vor Ort auf 40 Minuten komprimiert werden, was der Dauer der MMP-Analyse zuzüglich des durchflusszytometrischen Schritts der Spermienanalyse entspricht. Zweitens muss der Aufbau des Anschnitts in der durchflusszytometrischen Plattform für jede Probencharge separat entschieden werden. Die Spermienproben mit klaren Zelluntergruppen im Streudiagramm können als Referenz ausgewählt werden, um den Gating-Bereich zu zeichnen. Drittens, da es keine allgemein akzeptierten klinischen Referenzwerte für die Indikatoren dieses Experiments gibt, können historische Ergebnisse als wichtiges Instrument für die Qualitätskontrolle verwendet werden. Es wird auch empfohlen, Positiv- und Negativkontrollen in jeder Messcharge festzulegen, insbesondere für SCSA und MMP.
Die hier dargestellten repräsentativen Ergebnisse der Spermienanalyse wurden mit einem Accuri C6 abgeleitet. Die Technik könnte jedoch mit geringfügigen Modifikationen auch auf andere kommerzielle Plattformen angewendet werden. In der Regel werden insgesamt 5 × 106 Samenzellen benötigt, um die Anforderung für die Messung aller Indikatoren zu erfüllen. Wenn die Spermienkonzentration einer Probe viel niedriger als der Durchschnitt ist, würde der Bedarf an Samenvolumen steigen.
Ähnlich wie bei den routinemäßigen Spermienparametern gibt es auch bei menschlichen Spermien eine auffällige intraindividuelle Variation der Chromatinintegrität, des MMP und der Apoptose21. Dementsprechend können mehrere Tests von Proben, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden, eine genauere Schätzung des Schadensgrads der Spermienfunktion liefern. Obwohl es keine empfohlene Abstinenzzeit vor der Spermienentnahme für die durchflusszytometrische Analyse gibt, können 2-7 Tage ejakulatorische Abstinenz, die von der WHO für die routinemäßige Spermienanalyse empfohlen werden, angenommen werden. Es kann dazu beitragen, die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen Laboratorien und zwischen verschiedenen Proben, die von denselben Männern entnommen wurden, zu verbessern.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass zwei der drei getesteten Biomarker – die Apoptose und das mitochondriale Membranpotenzial – frische Samenproben erfordern. Dies kann ihre Anwendung auf Männer beschränken, die dem Labor Samenproben zur Verfügung stellen können. Für den Test von DNA-Schäden (SCSA) sollten vor dem Experiment Referenzproben vorbereitet werden, um das Durchflusszytometer zu kalibrieren. Zu beachten ist, dass die Anwendung des vorliegenden Protokolls ein FCM-Gerät im Labor erfordert, was für viele klinische Laboratorien immer noch eine erhebliche Herausforderung darstellt, obwohl die Zusammenarbeit mit einem Drittanbieter in einigen Regionen eine Alternative sein kann.
Darüber hinaus sind die Kosten für die Farbstoffe und andere Reagenzien auch ein finanzieller Faktor für Männer, die die Untersuchung benötigen. Schließlich muss das Protokoll möglicherweise geändert werden, wenn verschiedene Marken oder Versionen von FCM verwendet werden, um die Biomarker zu untersuchen. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit ein praktischer Ansatz zur Schätzung von drei Biomarkern für menschliche Spermienschäden mit einem einzigen Durchflusszytometriegerät vorgestellt. Dies kann wertvolle Informationen über die männliche reproduktive Gesundheit liefern und die routinemäßige Spermienuntersuchung ergänzen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Feldarbeitern für ihre Hilfe und den Interviewpartnern für ihre Mitarbeit.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
Riferimenti
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
