Analyse par cytométrie en flux de biomarqueurs pour la détection des défauts fonctionnels des spermatozoïdes humains
Summary
Le présent protocole fournit une solution pratique qui permet de mesurer l’apoptose, le potentiel de la membrane mitochondriale et les dommages à l’ADN dans les spermatozoïdes humains avec un seul cytomètre.
Abstract
L’analyse conventionnelle des paramètres du sperme est largement utilisée pour évaluer la fertilité masculine. Cependant, des études ont montré que ~ 15% des patients infertiles ne présentent aucune anomalie dans les paramètres conventionnels du sperme. Des technologies supplémentaires sont nécessaires pour expliquer l’infertilité idiopathique et détecter les défauts subtils des spermatozoïdes. Actuellement, les biomarqueurs de la fonction des spermatozoïdes, y compris l’apoptose des spermatozoïdes, le potentiel membranaire mitochondrial (MMP) et les dommages à l’ADN, révèlent la physiologie des spermatozoïdes au niveau moléculaire et sont capables de prédire la fertilité masculine.
Avec les techniques de cytométrie en flux (FCM), chacun de ces marqueurs peut être mesuré rapidement, avec précision et précision dans des échantillons de sperme humain, mais les coûts en temps augmentent considérablement et les résultats pourraient être obstrués si tous les biomarqueurs doivent être testés avec un seul cytomètre. Dans ce protocole, après le prélèvement et l’incubation immédiate à 37 °C pour la liquéfication, les échantillons de sperme ont été analysés plus en détail pour l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide d’une coloration à l’isothiocyanate d’annexine V-fluorescéine (FITC) et à l’iodure de propidium (PI). Le MMP a été marqué à l’aide d’une sonde de 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthyl-benzimidazolylcarbocyanine iodure (JC-1), et les dommages à l’ADN ont été évalués à l’aide du test de structure de la chromatine spermatique (SCSA) avec coloration à l’acridine orange (AO). Ainsi, l’analyse par cytométrie en flux des marqueurs de la fonction des spermatozoïdes peut être une boîte à outils pratique et fiable pour le diagnostic de l’infertilité et l’évaluation de la fonction des spermatozoïdes à la fois sur le banc et au lit.
Introduction
L’infertilité est devenue un problème de santé publique, l’infertilité masculine contribuant à 40 à 50 % de tous les cas 1,2. Bien que l’analyse conventionnelle de la qualité du sperme joue un rôle important dans la détermination du potentiel de fertilité masculine, environ 15 % des patients souffrant d’infertilité ont des paramètres de sperme normaux tels que le nombre, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes3. De plus, les examens de routine des spermatozoïdes ont une faible répétabilité, fournissent des informations limitées sur la fonction des spermatozoïdes et ne peuvent pas donner une évaluation précise de la fertilité masculine ou refléter les défauts subtils des spermatozoïdes. De multiples techniques ont été développées pour tester la fonction des spermatozoïdes, telles que le test de l’hémizona (HZA), le test de pénétration des spermatozoïdes, le test de gonflement hypo-osmotique, le test des anticorps antispermatozoïdes, mais ces méthodes prennent du temps et sont vulnérables aux influences subjectives des opérateurs. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes rapides et précises pour l’analyse de la fonction des spermatozoïdes.
La FCM est une technologie d’analyse rapide à cellule unique développée dans les années 1970, qui a été largement utilisée dans divers domaines de la biologie cellulaire et de la médecine. FCM est un outil robuste pour l’évaluation de la fonction des spermatozoïdes qui analyse les spermatozoïdes marqués à l’aide d’une sonde de fluorescence spécifique4. Les spermatozoïdes passent à travers des lasers monocanaux ou multicanaux, et la lumière diffusée et la fluorescence émise sont produites par un faisceau laser. La lumière diffusée comprend la lumière diffusée vers l’avant (FSC) et la lumière diffusée latéralement (SSC), qui reflète la taille de la cellule testée et la granularité cellulaire ou la structure interne. Ces signaux sont collectés, affichés et analysés par le système informatique et, par conséquent, une série de caractéristiques des spermatozoïdes sont mesurées rapidement et avec précision. Par conséquent, la FCM est une technique rapide, objective, multidimensionnelle et à haut débit qui a attiré de plus en plus l’attention dans le domaine de l’analyse du sperme. L’application de la FCM peut combler les lacunes des méthodes traditionnelles et fournit une nouvelle approche pour la détection de la structure interne et de la fonction des spermatozoïdes.
L’apoptose des spermatozoïdes est étroitement liée à la fertilité masculine5. La détection de l’apoptose des spermatozoïdes est un indice important pour évaluer la fonction des spermatozoïdes au niveau moléculaire. La FCM est largement reconnue comme une méthode fiable et sensible pour détecter l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide de la coloration à l’annexine V-FITC/PI. Le principe de base est que la phosphatidylsérine (PS) est transférée de la couche interne de la membrane cellulaire à sa couche externe au stade précoce de l’apoptose. L’annexine V est une protéine phospholipidique dépendante du Ca2+ (généralement marquée par FITC) qui a une forte affinité pour le PS, détectant ainsi le PS exposé à la surface externe de la membrane cellulaire6. La nécrose et l’apoptose peuvent être distinguées en combinaison avec la coloration Pl. Par conséquent, la méthode de double coloration de l’annexine V-FITC/PI est largement utilisée, car elle est rapide, simple et facile à détecter différents spermatozoïdes apoptotiques.
Un spermatozoïde de mammifère mature contient environ 72 à 80 mitochondries7, ce qui suggère une raison biologique à la rétention des mitochondries des spermatozoïdes8. Il a été démontré que les mitochondries des spermatozoïdes jouent un rôle important dans le maintien de la motilité et de la fertilité des spermatozoïdes9. La coloration JC-1, qui peut être utilisée comme indicateur de MMP dans une variété de types de cellules, est l’un des fluorochromes les plus populaires pour l’évaluation de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes10. JC-1 est un colorant cationique qui s’accumule de manière dépendante du potentiel dans les mitochondries. JC-1 a une émission de fluorescence maximale à 525 nm (vert) et forme des agrégats J 11 lorsqu’il se lie à des membranes à fort potentiel (ΔΨm, 80-100 mV), ce qui entraîne un décalage de l’émission de fluorescence à ~590 nm (orange-rouge). Par conséquent, la dépolarisation mitochondriale des spermatozoïdes est indiquée par une diminution du rapport d’intensité de fluorescence rouge/vert, et la FCM peut être utilisée pour détecter les niveaux de MMP dans les échantillons de sperme humain.
La méthodologie SCSA a été inventée par Evenson et al.12 et est considérée comme un test précis et reproductible avec des données uniques à double paramètre (fluorescence rouge vs verte) sur une échelle de 1 024 × 1 024 canaux 13. Dans les spermatozoïdes endommagés, l’ADN et les protéines altérées dans les noyaux des spermatozoïdes sont marqués par AO, et les cassures du brin d’ADN sont mesurées par fluorescence rouge, tandis que les doubles brins intacts émettent une fluorescence verte dans FCM14. De nos jours, de nombreuses méthodes ont été développées pour estimer l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes. Cependant, contrairement à l’ACSS, ces tests sont souvent à forte intensité de main-d’œuvre et ne permettent pas de diagnostiquer l’infertilité masculine. Les résultats du test SCSA sont significativement corrélés avec l’ADN humain, la grossesse et la fausse couche, fournissent des preuves convaincantes que l’ACS peut être utile dans l’analyse du sperme humain et peuvent servir d’outil précieux aux cliniciens de l’infertilité15.
L’intégrité de la chromatine, la MMP et l’apoptose reflètent différents aspects de la fonction des spermatozoïdes et, par conséquent, la combinaison de ces biomarqueurs peut fournir un aperçu plus complet de l’état des spermatozoïdes. Le FCM peut être utilisé pour des mesures distinctes de l’intégrité de la chromatine, de la MMP ou de l’apoptose dans des échantillons de sperme humain. Bien que le coût de la FCM et le coût des colorants aient limité l’application à grande échelle de ces techniques dans les laboratoires cliniques de santé génésique, leur valeur pour l’estimation de la fécondité est acceptée.
Cependant, comme chacune des expériences nécessite un prétraitement des échantillons de sperme et que tous les échantillons prétraités doivent être testés dès que possible, la mesure simultanée des trois biomarqueurs d’un échantillon avec un seul FCM peut entraîner un long temps d’attente pour certaines expériences et nuire à la fiabilité des résultats. En effet, les spermatozoïdes subissent des dommages supplémentaires pendant le processus d’attente, si le protocole n’est pas correctement organisé en tenant compte des trois expériences. Cet article présente un protocole qui permet de mesurer de manière fluide les trois biomarqueurs dans une seule cytométrie sans compromettre substantiellement la qualité de l’expérience induite par des temps d’attente prolongés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’intégrité de la chromatine, la MMP et l’apoptose des spermatozoïdes humains se sont avérées être des prédicteurs précieux des résultats de la reproduction. Le dernier manuel de laboratoire de l’OMS pour l’examen et le traitement du sperme humain (sixième édition) a également mis en évidence certains de ces indicateurs (intégrité de la chromatine et apoptose) comme des examens étendus au-delà de l’examen de base de paramètres de routine tels que le nombre de spermatozoïdes18. Des publications récentes suggèrent également que ces indicateurs pourraient être des marqueurs plus sensibles de la réponse à des expositions externes dangereuses, indiquant leur potentiel pour l’identification des dommages à la reproduction à un stade plus précoce19,20. La combinaison de ces indicateurs avec des examens de routine peut également fournir une compréhension plus complète du profil du dysfonctionnement des spermatozoïdes et de la complexité des dommages à la reproduction masculine dans la population.
Il y a plusieurs questions clés qui déterminent de manière substantielle le succès de l’analyse du sperme avec la FCM. Tout d’abord, la mesure de la MMP et de l’apoptose des spermatozoïdes nécessite un examen immédiat après la liquéfaction du sperme. Pour minimiser le coût en temps, deux techniciens peuvent prendre en charge séparément le prétraitement de la MMP et l’analyse de l’apoptose d’un échantillon. Comme le prétraitement de l’apoptose est plus simple, il serait transféré à l’étape de cytométrie en flux plus rapidement que l’analyse MMP. Pour l’analyse de l’ASCR, les échantillons de sperme frais doivent être cryoconservés dès qu’ils sont disponibles après liquéfaction. Les échantillons de sperme peuvent ensuite être conservés dans de l’azote liquide pendant une période relativement longue et ne nécessitent pas d’examen immédiat.
En conséquence, le coût du temps sur site de l’expérience peut être compressé à 40 minutes, ce qui correspond à la durée de l’analyse MMP plus l’étape de cytométrie en flux de l’analyse du sperme. Deuxièmement, la configuration de la grille dans la plate-forme de cytométrie en flux doit être décidée séparément pour chaque lot d’échantillons. Les échantillons de spermatozoïdes avec des sous-groupes de cellules claires dans le nuage de points peuvent être sélectionnés comme référence pour dessiner la zone de contrôle. Troisièmement, comme il n’existe pas de valeurs de référence cliniques largement acceptées pour les indicateurs de cette expérience, les résultats historiques peuvent être utilisés comme un outil important pour le contrôle de la qualité. Il est également recommandé d’établir des contrôles positifs et négatifs dans chaque lot de mesures, en particulier pour l’ACTS et le MMP.
Les résultats représentatifs de l’analyse du sperme fournis ici sont obtenus à l’aide d’un Accuri C6. Cependant, la technique pourrait être appliquée à d’autres plates-formes commerciales avec des modifications mineures. Habituellement, un total de 5 × 10 à 6 spermatozoïdes serait nécessaire pour répondreà l’exigence de mesure de tous les indicateurs. Si la concentration de spermatozoïdes d’un échantillon est beaucoup plus faible que le niveau moyen, le besoin de volume de sperme augmenterait.
Comme pour les paramètres de routine des spermatozoïdes, il existe également une variation intraindividuelle notable de l’intégrité de la chromatine, de la MMP et de l’apoptose des spermatozoïdes humains21. En conséquence, plusieurs tests d’échantillons prélevés à différents moments peuvent fournir une estimation plus précise du niveau de dommages à la fonction des spermatozoïdes. Bien qu’il n’y ait pas de période d’abstinence recommandée avant le prélèvement de spermatozoïdes pour l’analyse par cytométrie en flux, 2 à 7 jours d’abstinence éjaculatoire, suggérés pour l’analyse de routine du sperme par l’OMS, peuvent être adoptés. Cela peut aider à améliorer la comparabilité des résultats entre les laboratoires et entre les différents échantillons prélevés sur les mêmes hommes.
Une limitation majeure de cette méthode est que deux des trois biomarqueurs testés – l’apoptose et le potentiel membranaire mitochondrial – nécessitent des échantillons de sperme frais. Cela peut limiter leur application aux hommes qui peuvent fournir des échantillons de sperme au laboratoire. Pour le test de dommages à l’ADN (SCSA), des échantillons de référence doivent être préparés avant l’expérience pour calibrer le cytomètre en flux. Il convient de noter que l’application du présent protocole nécessite l’utilisation d’un instrument FCM dans le laboratoire, ce qui représente encore un défi considérable pour de nombreux laboratoires cliniques, bien que la coopération avec un service tiers puisse être un choix alternatif dans certaines régions.
De plus, le coût des colorants et autres réactifs est également un facteur financier pour les hommes qui peuvent avoir besoin de l’examen. Enfin, il peut être nécessaire de modifier le protocole si différentes marques ou versions de FCM sont utilisées pour examiner les biomarqueurs. En résumé, cet article présente une approche pratique pour estimer trois biomarqueurs des dommages causés aux spermatozoïdes humains par un seul appareil de cytométrie en flux. Cela peut fournir des informations précieuses sur la santé reproductive masculine et compléter l’examen de routine du sperme.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les acteurs de terrain pour leur aide et les personnes interrogées pour leur coopération.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
Riferimenti
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