Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF
Summary
MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.
Abstract
L’RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l’RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l’ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l’RNA e l’esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5′ e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all’identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all’identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione e/o la rilevazione di molecole di varie dimensioni e caratteristiche. Alcuni dei suoi usi includono diverse applicazioni come il rilevamento di tannini dalle risorse naturali4, l’imaging di metaboliti negli alimenti5, la scoperta o il monitoraggio di bersagli o marcatori di farmaci cellulari6 e la diagnostica clinica7, per citarne alcuni. Di rilevanza per il presente lavoro è l’uso di MALDI-TOF con DNA o RNA, con il suo uso su oligonucleotidi risalenti a oltre tre decenni8, dove sono state notate diverse limitazioni. Questa tecnica si è ora evoluta in un mezzo affidabile e comunemente usato per caratterizzare entrambi i biopolimeri9 e identificare / comprendere reazioni chimiche e biochimiche, ad esempio, caratterizzazione di siti platinati in RNA10, identificazione di frammenti di RNA a seguito di scissione del filamento 11,12 o formazione di legami incrociati proteina-DNA13 . Pertanto, è utile illustrare ed evidenziare aspetti importanti dell’utilizzo di questa tecnica. Le basi di MALDI-TOF sono state descritte anche in formato video14 e non saranno ulteriormente elaborate nel presente documento. Inoltre, la sua applicazione in un contesto di DNA o proteine è stata precedentemente descritta e illustrata nel suddetto formato 15,16,17.
Il protocollo per la rilevazione di frammenti di RNA formatisi dopo idrolisi enzimatica è riportato qui. Il modello sperimentale è stato scelto sulla base di una recente scoperta pubblicata dal nostro gruppo18, in cui MALDI-TOF è stato utilizzato per determinare la reattività unica tra l’esoribonucleasi Xrn-1 e gli oligonucleotidi dell’RNA contenenti la lesione ossidativa 8-oxoG. I filamenti lunghi a 20 nucleotidi sono stati ottenuti tramite sintesi in fase solida19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mentre Xrn-1 è stato espresso e purificato seguendo il rapporto20 precedentemente descritto. In breve, Xrn-121 è un’esoribonucleasi 5′-3′ con vari ruoli biologici chiave che degradano più tipi di RNA, incluso l’RNAossidato 22. Si è scoperto che la processività dell’enzima si blocca incontrando 8-oxoG, che ha portato a frammenti di RNA contenenti estremità 5′-fosforilate [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Infine, è importante notare che la spettrometria di massa è un metodo potente che, attraverso varie metodologie, può essere adattato ad altri scopi23,24; pertanto, la scelta del giusto metodo di ionizzazione e di altre impostazioni sperimentali è della massima importanza.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sfida principale in questo flusso di lavoro è sorta tra la finalizzazione degli esperimenti e l’esecuzione delle analisi spettrometriche di massa. Gli esperimenti sono stati condotti e completati presso l’Università del Colorado a Denver e spediti (durante la notte) alle strutture della Colorado State University. L’acquisizione dei dati è stata effettuata al momento del ricevimento, come da convenienza. Diverse circostanze impreviste hanno portato a ritardi nel processo. In un caso, malfunzionamenti imprevisti dell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
È importante notare che questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo tra tre istituzioni, due gruppi di ricerca e una struttura principale. La distribuzione e il carico di lavoro sono stati effettuati come segue: L’espressione della proteina (Xrn-1) è stata effettuata presso l’Università di Denver (Denver, CO). La sintesi, la quantificazione e la sperimentazione degli oligonucleotidi (principalmente la degradazione enzimatica) sono state condotte presso l’Università del Colorado Denver (Denver, CO). L’ottimizzazione è stata effettuata anche lì. L’individuazione, l’acquisizione e l’analisi di MALDI-TOF sono state effettuate presso l’Analytical Resources Core Facility della Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS desidera riconoscere un urop award (CU Denver) e le sovvenzioni Eureca (CU Denver) per il supporto. E. G.C. riconosce il supporto di NIGMS, tramite R00GM115757. MJER riconosce il supporto di NIGMS, tramite 1R15GM132816. K.B. riconosce l’ID risorsa: SCR_021758. Il lavoro è stato anche sostenuto da un Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, dalla Henry Dreyfus Foundation.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
Riferimenti
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