Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ingegneria

التصوير الكيميائي متعدد الإرسال القائم على مجهر رامان لتشتت رامان المحفز عريض النطاق

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

نقدم بروتوكولا للحصول على صور كيميائية باستخدام مجهر تفريق رامان (SRS) المحفز عريض النطاق. استنادا إلى مجهر SRS الذي يعمل مع الكشف التفاضلي متعدد القنوات ، يصف البروتوكول إعداد العينة ، وتعديل جهاز SRS ، والقياسات الكيميائية لفك تشابك المكونات المختلفة للعينات غير المتجانسة كيميائيا.

Abstract

المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية بصرية غير خطية للتصوير الكيميائي الخالي من الملصقات. توفر هذه الأداة التحليلية خرائط كيميائية بسرعة عالية ودقة مكانية عالية للعينات الرقيقة عن طريق استجواب اهتزازاتها الجزيئية مباشرة. في تنفيذه القياسي ، يكون الفحص المجهري SRS ضيقا النطاق ويشكل صورا بتردد اهتزازي واحد فقط في المرة الواحدة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يعيق الخصوصية الكيميائية ل SRS فحسب ، بل يهمل أيضا ثروة المعلومات المشفرة داخل الأطياف الاهتزازية.

ويمكن التغلب على هذه القيود بواسطة نظام SRS عريض النطاق، وهو تطبيق قادر على استخراج طيف اهتزازي لكل بكسل من الصورة بالتوازي. وهذا يوفر بيانات فائقة الطيف التي، عندما تقترن بالتحليل الكيميائي، تزيد من كمية المعلومات المستردة من العينة. وبالتالي ، فإن SRS عريض النطاق يحسن الخصوصية الكيميائية للنظام ، مما يسمح بالتحديد الكمي لتركيز المكونات المختلفة للعينة. هنا ، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول للتصوير الكيميائي باستخدام مجهر SRS عريض النطاق ، استنادا إلى مجهر SRS محلي الصنع يعمل مع اكتشاف مضخم صوت متعدد القنوات تفاضلي مخصص. ويناقش إعداد العينة، ومحاذاة جهاز SRS، والتحليل الكيميائي. من خلال الحصول على أطياف رامان الاهتزازية ، يوضح البروتوكول كيفية تحديد الأنواع الكيميائية المختلفة داخل الخليط ، وتحديد تركيزاتها النسبية.

Introduction

مجهر رامان هو تقنية تصوير قوية توفر خرائط كيميائية غنية عن طريق قياس تشتت رامان¹ ، وهي عملية إشعاعية غير مرنة تنشأ من جزيئات تهتز استجابة للضوء الساقط ^2,3. يحتوي كل بكسل من خريطة رامان على طيف يحمل معلومات مباشرة عن التركيب الكيميائي للعينة وبنيتها، مما ينتج عنه صور ذات تباين اهتزازي جوهري. حتى الآن ، يعد مجهر رامان وجهة النظر المرجعية لدراسات التحليل الطيفي المجهري للاهتزازات الجزيئية حيث لا يمكن لأي تقنية تصوير أخرى إنتاج صور ذات خصوصية كيميائية عالية ودقة مكانية عالية⁴. وعلى الرغم من خصوصيته الكيميائية المتميزة، فإن كفاءة توليد تشتت رامان منخفضة، مما يستدعي إما أوقات سكن البكسل الممتدة أو الإثارة عالية الطاقة، مما يؤدي، على التوالي، إلى انخفاض معدلات الاكتساب وعدم التوافق مع العينات الحساسة.

هذا النقص الفردي في مجهر رامان دفع الباحثين إلى تطبيق تشتت رامان المتماسك⁵،⁶^،⁷،⁸^،⁹ كمصدر للتباين للفحص المجهري. هذه عملية بصرية غير خطية تعزز الاستجابة الاهتزازية بعدة أوامر (تصل إلى سبعة) من الحجم ، مما يسمح بالتصوير الكيميائي عالي السرعة¹⁰،¹¹^،¹²^،¹³. وعلى وجه الخصوص، فإن تقنيتي تشتت رامان الأكثر تماسكا هما تشتت رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS)¹⁴ وتشتت رامان المحفز (SRS)¹⁵. على النقيض من CARS ، يظهر SRS اعتمادا خطيا على تركيز الجزيئات الرنانة. إنه محصن ضد الخلفية غير الرنانة ، وهو تأثير غير خطي لا علاقة له بأي انتقال اهتزازي ولكنه مشوه لأشكال لورنتزيان المميزة لأطياف رامان للاهتزازات الجزيئية^16,17. وبالتالي ، فإن الفحص المجهري SRS ينتج معلومات رامان الأصلية التي تسمح بتحليل الصور الكمي المباشر.

SRS هي عملية بصرية غير خطية من الدرجة الثالثة توفر معلومات مباشرة عن الروابط الكيميائية للعينة. وهو ينشأ من التراكب الزماني المكاني لحقلين بصريين عموما في المنطقة الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء، وهما المضخة وستوكس عند التردد ω_pu و ω_S، على التوالي^10،11^،¹⁸. يولد هذا التراكب ضربا عند فك تشفير تردد المضخة ستوكس Ω = ω_pu-ω _S. عندما يتطابق Ω مع اهتزاز جزيئي Ω_R ، يتردد صدى الجزيء ، مما يتسبب في نقل متماسك للطاقة بين حقول الضوء والجزيء. نتيجة لذلك ، يصل الجزيء إلى حالة إثارة اهتزازية. يمكن مراقبة هذه العملية عن طريق قياس إما إبادة فوتونات المضخة (إشارة تعرف باسم فقدان رامان المحفز [SRL]) أو التضخيم المصاحب لفوتونات ستوكس (وهي عملية تعرف باسم كسب رامان المحفز [SRG]). SRG و SRL هي إشارات صغيرة (ΔI) تجلس فوق خلفية مكثفة ومتقلبة (I). نظرا لأن القيم النموذجية لإشارة SRS (ΔI / I) تقع في نطاق ^10-6-10-4 ، فإن ضوضاء الليزر يمكن أن تحجبها بسهولة. للتخفيف من الآثار الضارة لضوضاء الليزر على نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وبالتالي على سرعة التصوير ، يعتمد اكتشاف SRS على تقنيات نقل التشكيل (مثل مكبرات الصوت القفلية أو الدوائر الرنانة أو متوسطات السيارات الصندوقية) عند ترددات التشكيل العالية (>1 ميجاهرتز) ، حيث تصل ضوضاء الليزر إلى قيمها الدنيا¹⁵،¹⁹^،²⁰.

يستخدم الفحص المجهري SRS التقليدي مضخة ضيقة النطاق (≈10 سم−1) ونبضات ستوكس لإنتاج صور كيميائية بتردد اهتزازي واحد ، مما يسمح بالتصوير بمعدل الفيديو مع أوقات سكن البكسل منخفضة تصل إلى ≈100 ns^21,22. ومع ذلك ، نظرا لأن الفحص المجهري SRS ضيق النطاق يشكل خرائط كيميائية عن طريق مسح العينة بالتتابع على عدد قليل من الترددات الاهتزازية ، فإن معلوماتها محدودة²³. قد لا تكفي صور SRS ذات التباين الاهتزازي واحد أو اثنين للتمييز بين الأنواع الكيميائية ذات نطاقات رامان المتداخلة ، خاصة داخل الأنظمة غير المتجانسة. لذلك ، فإن مجهر SRS النموذجي ضيق النطاق لا يستغل الإمكانات الكاملة ل SRS ، لأن التحقيق في حفنة من الترددات الاهتزازية يعوق خصوصيته الكيميائية ويهمل ثروة المعلومات المشفرة داخل أطياف الاهتزاز. علاوة على ذلك، يؤدي المسح المتسلسل للعينة بترددات مختلفة إلى أوقات سكن البكسل الممتدة التي يمكن أن تؤدي إلى تلف ضوئي ومنع التسجيل المكاني الدقيق بين الصور المتتالية، مما يؤدي إلى قطع أثرية متحركة.

على عكس نظيره ضيق النطاق ، يسترد الفحص المجهري SRS عريض النطاق طيفا اهتزازيا لكل بكسل في كل عينة مسح¹⁰،¹²^،²⁴. وبالتالي ، يوفر SRS عريض النطاق تصويرا طيفيا فائقا مع تسجيل مكاني صارم للتباينات الاهتزازية المختلفة ، مما يسمح بتحليل دقيق للبيانات. هذا لا يكشف فقط عن المكونات الكيميائية للعينة من خلال أطياف رامان ، ولكنه يساعد أيضا على تحديد تركيزاتها النسبية. اعتمادا على كيفية الحصول على الأطياف ، يتم تصنيف الفحص المجهري SRS عريض النطاق إما على أنه SRS فائق الطيف أو SRS متعدد الإرسال. في SRS الفائق الطيف ، يتم الحصول على طيف SRS لكل نقطة ممسوحة ضوئيا من العينة بالتتابع (أي يتم استرداده عن طريق مسح التردد Ω) ، وبناء طيف SRS عن طريق تكديس إشارات SRS معا في نوبات رامان المتتالية. يتم قياس طيف رامان في وقت واحد في عدة أوضاع اهتزازية في SRS متعدد الإرسال. وهكذا، يجمع نهج SRS المتعدد الإرسال بين نبضة ضيقة النطاق معدلة ونبضة عريضة النطاق لدفع إشارة SRS بترددات مختلفة، ويستخدم كاشفا متعدد القنوات بحساسية مماثلة لحساسية SRS ضيقة النطاق للكشف عن أطياف SRS.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج خرائط كيميائية لعينات غير متجانسة باستخدام مجهر SRS متعدد الإرسالات. ويبين الشكل 1 مخططا لمجهر SRS المستخدم في هذا البروتوكول ويوصف بالتفصيل في مكان آخر^25,26,27. باختصار ، يقوم ليزر ألياف Yb التجاري المقفل في الوضع ، والذي ينتج نبضات 140 fs مركزها 1040 نانومتر ، بمتوسط طاقة 10 واط ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز ، بتشغيل مجهر SRS عريض النطاق. يفصل مقسم الشعاع المستقطب (PBS) الحزمة الأساسية إلى فرعين. لإنتاج نبضات ستوكس ضيقة النطاق، يتم إرسال فرع واحد مع 4 واط من الشعاع الأساسي إلى etalon الذي يولد شعاع ضيق النطاق (≈15 ^سم-1)، والذي يتم تعديله بعد ذلك عند 1.6 ميغاهيرتز مع المغير البصري الصوتي (AOM). الجزء المتبقي مع 6 واط من الحزمة الأساسية يتضاعف التردد مع بلورة ليثيوم ثلاثية (LBO) بسماكة 2.8 مم ، مقطوعة لمطابقة المرحلة من النوع الأول (θ = 90 درجة ، φ = 13.8 درجة). ينتقل الجيل التوافقي الثاني الناتج عند 520 نانومتر إلى تجويف مطوي X لضخ مذبذب بصري بارامتري (OPO) ، وهو جهاز يستخدم بلورة LBO بسماكة 3.0 مم (مطابقة المرحلة من النوع الأول ، θ = 90 درجة ، φ = 9.8 درجة) كوسط نشط لتقديم إشعاع بصري عريض النطاق قابل للضبط داخل المنطقة الطيفية 680-910 نانومتر (الشكل 2). تعمل هذه النبضات عريضة النطاق كمضخة في تجارب SRS وتنتشر إلى ضاغط منشور للتعويض المسبق عن تأثيرات التشتت الناجمة عن هدف المجهر.

بعد مرحلة الضغط ، تنتج لوحة موجية λ/2 ، جنبا إلى جنب مع لوحة YVO₄ ثنائية الانكسار ، نسختين متماثلتين مستقطبتين متعامدتين يلغي طرحهما الإلكتروني في مستوى الكشف ضوضاء مضخة النطاق العريض. تجمع المرآة ثنائية اللون بين المضخة وعوارض ستوكس وترسلها إلى مجهر مستقيم. ويركز هدف الغمر بالماء بفتحة عددية (NA) تبلغ 1.27 الضوء على العينة، بينما يقوم هدف غمر الزيت بفتحة غير متوقعة تبلغ 1.4 بتجميعه. قبل مرحلة الكشف، يزيل مرشح التمرير القصير (SPF) ستوكس المعدلة، بينما يعمل صريف الحيود الذي يعمل في تكوين Littrow على تشتيت مضخة النطاق العريض المرسلة. يفصل PBS₂ الثاني النسخ المتماثلة للمضخة ، وتركز العدسة على صفيفين من الصمام الثنائي الضوئي. يتم طرح الإشارات من صفائف الصمام الثنائي الضوئي هذه إلكترونيا وإرسالها إلى مضخم صوت متعدد القنوات (M-LIA) تم بناؤه في المنزل. ثم يتم تطبيع الإشارة المسحوبة بواسطة قراءات التيار المباشر (DC) لأحد صفائف الصمام الثنائي الضوئي ، وبالتالي إنتاج طيف SRL.

كتجربة مثالية، نقوم بتصوير مخاليط من العديد من مبعثرات رامان المعروفة، ولكل منها طيف رامان فريد. وبالتالي ، يبدأ البروتوكول بوصف كيفية إعداد العينات المرجعية. بينما نكتشف SRL ، نواصل شرح كيفية الحصول على نبضات Stokes ضيقة النطاق وإعداد المصدر البصري الذي يوفر نبضات مضخة النطاق العريض (≈250 سم ^{– 1}) ، أي OPO محلي الصنع. ويبين البروتوكول محاذاة الحزم البصرية وتحسينها، واصفا البارامترات الحرجة مثل قدرة وأطياف ستوكس ضيقة النطاق ومضخة النطاق العريض. يصف البروتوكول بالتفصيل المسار البصري لمضخة النطاق العريض لأنه يتطلب عناصر بصرية خاصة. كما يشرح كيفية العثور على التداخل الزماني المكاني بين نبضات Pump-Stokes ويوضح طريقة عملية لتحديد ضوضاء الشدة النسبية (RIN) ، والتي بدورها تساعد في تحديد أفضل تردد تعديل لتجارب SRS. ثم نوضح مبدأ العمل ومعايرة سلسلة الكشف. أخيرا ، يعرض البروتوكول عملية الحصول على البيانات والقياسات الكيميائية وخط أنابيب معالجة الصور.

Protocol

1. إعداد العينات ملاحظة: يصف هذا البروتوكول استرجاع خرائط التركيز وأطياف SRS المميزة للمخاليط غير المتجانسة كيميائيا. لإعداد العينة، استخرج 2 ميكرولتر من تعليق مائي لميكروبيدات البولي ميثيل ميثاكريليت (PMMA) (انظر جدول المواد) وصب الكسر 2 ميكرولتر على غطاء مجهري. باستخدام طرف ماصة نظيف ، استخرج 2 ميكرولتر من تعليق مائي من ميكروبيدات البوليسترين (PS) وادمجه مع تعليق PMMA على الغطاء. باستخدام طرف ماصة ، امزج التعليق بلطف واتركه يجف لمدة 24 ساعة.ملاحظة: من المهم مطابقة تركيز معلقات الميكروبيدات بعناية لتجنب الكميات غير المتناسبة من الميكروبيدات على سطح العينة. قطر حبات PS و PMMA هو 10 و 6 ميكرومتر ، على التوالي. تسمح هذه الأبعاد بإظهار الدقة المكانية العالية للمجهر دون المساس بكفاءة توليد SRS. فوق الطبقة البيضاء المسطحة من الخرز التي ستظهر عندما يجف الماء ، أضف 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ثم 20 ميكرولتر من زيت الزيتون النقي. ضع طلاء الأظافر على حواف غطاء المجهر الثاني. ضع الغطاء على الخليط ، مع توجيه طلاء الأظافر لأسفل ، مع تطبيق ضغط كاف لإغلاقه. اتركه يجف.ملاحظة: يوضح الشكل 3 النتائج المثالية التي تم الحصول عليها من خلال هذه الخطوات. إذا تم إغلاقها بشكل صحيح ، فيجب أن تستمر هذه العينة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. 2. تحسين المضخة وحزم ستوكس قم بتشغيل الليزر ، واتركه يصل إلى التوازن الحراري. تطبيق تشتت تأخير المجموعة السالب (GDD) من GDD = -6000 fs2 على الحزمة الأساسية.ملاحظة: تعد قيمة GDD هذه ضرورية لقيادة OPO بنجاح وهي مثالية لهذا الإعداد ولكن من المحتمل أن تختلف في الأنظمة المختلفة. يمكن إدخال GDD السلبي من خلال أزواج الصريف أو ضواغط المنشور أو أجهزة تشكيل النبض بناء على معدلات الضوء المكانية28. قسم الليزر الأساسي باستخدام مقسم شعاع الاستقطاب (PBS1) إلى فرعين. للحصول على نبضات ستوكس ضيقة النطاق، قم بتوجيه فرع واحد بقدرة 4 واط إلى إيتالون. قم بتدوير etalon قليلا حتى يتم الحصول على خط طيفي ضيق وتمركزه في ذروة طيف النبضة (انظر المنحنى الأحمر في الشكل 2).ملاحظة: يتمتع هذا الإيتالون ببراعة فعالة تبلغ 29 ومدى طيفي حر يبلغ 29.8 نانومتر عند 1040 نانومتر. للحصول على نبضات ستوكس معدلة، أرسل شعاع النطاق الضيق إلى مغير بصري أكوستو.ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 4A، فإن الحزمة المنحرفة من الدرجة الأولى تواجه تحويتا بنسبة 100٪، في حين أن الحزمة المنحرفة من الدرجة الأولى تعاني من 50٪ فقط. لذلك ، يفضل استخدام الترتيب الأول لتجنب إضاءة العينة بشعاع قوي غير معدل قد يؤدي إلى تلف ضوئي للعينة دون توليد أي إشارة SRS. لتحسين كفاءة التشكيل، قم بتغيير المسافة بين العدستين f1 و f2 (الشكل 4B). قم بقياس الشعاع المعدل باستخدام صمام ثنائي ضوئي وسجل ملفه الشخصي باستخدام منظار الذبذبات. قم بتغيير المسافة بين f1 و f2 حتى يتم تحقيق أقصى تباين بين السعة وخط الأساس لقراءات الذبذبات.ملاحظة: لا يعمل هذا الزوج من العدسات كمصادم، ولكنه يخلق نقطة بؤرية فعالة في بلورة AOM. ضع عدسة ثالثة f3 لضبط خصر شعاع ستوكس ، مما يسمح بتغيير حجم التفاعل في المستوى البؤري للمجهر ، وبالتالي تحسين إشارة SRS.ملاحظة: تم تعديل شعاع ستوكس عند MHz 1.6 في هذا البروتوكول. ركز 6 واط المتبقية من القدرة البصرية للشعاع الأساسي على بلورة ثلاثية الليثيوم (LBO) (LBO 1 ، θ = 90 درجة، φ = 13.8 درجة) إلى تردد ضعف الحزمة الأساسية من خلال الجيل التوافقي الثاني (SHG) (الشكل 5A). لزيادة كفاءة SHG إلى أقصى حد ، قم بتدوير الكريستال قليلا ، مع تغيير زاوية φ (الشكل 5B). قم بتحسين LBO1 للحصول على 2.5 واط على الأقل من SHG. اضبط الزاوية φ ل LBO2 لزيادة كفاءة توليد شعاع الإشارة إلى أقصى حد.ملاحظة: تم اختيار الأطوال البؤرية للعدسات f1 و f2 و f3 بعناية لمطابقة شعاع SHG مع تجويف OPO. وبالتالي ، فإن الأطوال البؤرية لهذه العدسات تختلف في إعدادات مختلفة. بسبب التشتت المتبقي في تجويف OPO ، يؤدي التغيير الطفيف في طول التجويف إلى حدوث تحول في طيف شعاع الإشارة. اضبط طول التجويف للحصول على طيف مضخة يمكنه، جنبا إلى جنب مع ستوكس ضيق النطاق عند 1,040 نانومتر، إنتاج تردد يتم ضبطه في حدود 1,373-5,090 سم-1. يغطي هذا النطاق الاهتزازات في المنطقة الطيفية الممتدة CH (2,800-3,050 cm-1). انظر الأطياف الزرقاء في الشكل 2. للتعويض عن تأثيرات التشتت الناجمة عن هدف مجهر الإثارة ، أرسل مضخة النطاق العريض إلى ضاغط منشور. أدخل المضخة في المنشور A من خلال قمتها وقم بتوجيه المضخة المشتتة نحو قمة المنشور B. حدد مقدار التشتت السلبي اللازم ، ثم اضبط المسافة بين شقوق المنشور L وفقا لذلك.ملاحظة: يوضح الشكل 6 ترتيب المنشور29. وفي هذه الحالة، حدد التعويض عن GDD ≈ -12,800 fs2؛ وبالتالي L = 1.26 م. استخدم منشورات بروستر المقطوعة. تأكد من أن استقطاب شعاع المضخة يقع داخل المستويات المثلثة للمنشورات (الوجوه العلوية / السفلية غير المصقولة). تأكد من أن زاوية الحدوث θفي شعاع المضخة تتطابق مع زاوية بروستر. تأكد من أن وجه خروج المنشور A مواز لوجه مدخل المنشور B. لتقدير GDD لنبضة النطاق العريض المراد تعويضها ، قم بقياس إشارة SRS عند طول موجي واحد λ 1 ، مع تسجيل التأخير الزمني τ 1 بين المضخة Stokes التي يتم فيها الحصول على الحد الأقصى SRS (λ1). كرر هذا الإجراء لطول موجي ثان λ 2 ، وسجل مرة أخرى التأخير الزمني τ 2 الذي كان فيه SRS (λ2) هو الحد الأقصى.ملاحظة: نظرا لأن GDD يعرف بأنه مشتق من تأخير المجموعة فيما يتعلق بالتردد الزاوي، فإن القياسات المذكورة أعلاه تسمح بتقدير GDD لحزمة النطاق العريض (Eq [1]).(1) باستخدام صفيحة موجية λ/2 ، اضبط استقطاب شعاع المضخة على 45 درجة. قم بتوجيه المضخة المستقطبة إلى لوحة YVO4 بطول 13.3 مم ، مما يحدد المحور السريع لهذا العمودي البلوري ثنائي الانكسار.ملاحظة: عند السفر عبر لوحة YVO4 ، سيتم تقسيم نبضات المضخة إلى نسختين متماثلتين مستقطبتين متعامدتين تنتشران بشكل مبكر ولكن مع الحفاظ على تأخير Δt ≈ 10 ps بينهما. هذا التأخير هو دالة على سمك ومؤشرات الانكسار للبلورة ثنائية الانكسار. فيما بعد ، ستسمى النسخ المتماثلة للمضخة التي لها نفس حالة الاستقطاب لنبضات ستوكس “إشارة” بينما تسمى تلك التي لها حالة متعامدة باسم “المرجع”. تم وصف تفاصيل هذه التقنية ، التي تسمى الكشف المتوازن المضمن ، سابقا30. اجمع بين المضخة وعوارض ستوكس مع مرآة ثنائية اللون وقم بمحاذاتها بعناية باستخدام زوج من الثقوب الفلورية ، مما يضمن انتشار كليهما بشكل مبكر. قم بتخفيف الحزم واستخدام عدسة لتركيزها على صمام ثنائي ضوئي سريع (عرض نطاق ترددي 100 ميجاهرتز على الأقل). قم بحظر المضخة وقياس نبضات Stokes المفردة باستخدام منظار ذبذبات رقمي عالي النطاق الترددي. استخدم إشارة الزناد الخاصة بالليزر كمصدر الساعة لقياسات الذبذبات. أوجد متوسط القيمة التي يصل عندها جهد الصمام الثنائي الضوئي إلى الحد الأقصى. احجب شعاع ستوكس وكرر هذا الإجراء لنبضات المضخة. قم بزيادة أو تقليل المسار البصري لشعاع المضخة (ستوكس) حتى تصل نبضاتها تقريبا في نفس الوقت الذي تصل فيه نبضات ستوكس (المضخة).ملاحظة: يجب أن يضمن ذلك دقة بضعة ملليمترات كحد أقصى في مطابقة فرق المسار البصري بين الذراعين. قم بإزالة الصمام الثنائي الضوئي ووضع بلورة غير خطية بزاوية قطع مناسبة لتوليد مجموع التردد (SFG) بين فوتونات Pump-Stokes.ملاحظة: تم قطع البلورة غير الخطية المستخدمة هنا لمطابقة المرحلة من النوع الأول ، θ = 90 درجة ، φ = 9.8 درجة. يجب أن يكون المحور البصري للبلورة غير الخطية موازيا لاستقطاب ستوكس ونبضات الإشارة. اجعل المضخة / حزم ستوكس غير خطية قليلا وحرك خط التأخير حتى SFG ، وهي إشارة ، بسبب مطابقة الطور ، بين SHGs للمضخة وعوارض ستوكس. إذا لم يتم العثور على الإشارة ، فتحقق من التداخل المكاني للحزمتين على البلورة.ملاحظة: يتحول SFG إلى اللون الأزرق ويجب أن يكون مرئيا بسهولة للعين المجردة. في حالة وجود صعوبات غير متوقعة ، ضع مرشحا منخفض المرور لإزالة المضخة و Stokes و SHGs الخاصة بكل منهما وقياس SFG باستخدام مقياس الطيف (الشكل 7A). أوجد التأخير الزمني الذي يصل فيه SFG إلى أقصى كثافة له، وهي قيمة تحدد التداخل الزماني المكاني المثالي المطلوب لتوليد الإشارة غير الخطية، وقم بإصلاح خط التأخير هناك (الشكل 7B). قم بقياس ملامح الشعاع باستخدام كاميرا معايرة. بدلا من ذلك ، استخدم بطاقة الأشعة تحت الحمراء وتقدير الأقطار بالعين. استخدم تلسكوبين، أحدهما للمضخة والآخر لشعاع ستوكس. باستخدام هذه التلسكوبات ، حاول مطابقة أقطار الحزمة مع الفتحة الخلفية لهدف الإثارة.ملاحظة: سيضمن هذا الإجراء الدقة المكانية القصوى للإعداد. بمجرد الحصول على إشارة SRS ، استخدم التلسكوب الموجود على شعاع المضخة لتعديل قطره ، وتغيير نطاق Rayleigh الخاص به ، وبالتالي حجم التفاعل في بؤرة المجهر. توقف عند تحقيق الحد الأقصى ل SRS. استخدم الصمام الثنائي الضوئي لقياس شدة شعاع المضخة (ستوكس) ، ومع مسؤولية الصمام الثنائي الضوئي ، احسب متوسط الطاقة التي تؤثر على المنطقة النشطة للكاشف. في حالة استخدام صمام ثنائي ضوئي عالي النطاق الترددي، قم بتوصيل مرشح إلكتروني منخفض التمرير للحصول على المكون الثابت أو DC فقط. لقياس δP(f)، قم بتوصيل مخرج صمام ثنائي ضوئي عالي النطاق الترددي (افصل مرشح التمرير المنخفض) بإدخال مضخم صوت قفل. قم بتخزين مخرجات القفل في ترددات إزالة الدموليز المختلفة ، واستخدم مسؤولية الصمام الثنائي الضوئي للتحويل من V إلى W.ملاحظة: تحتوي مكبرات الصوت التجارية المقفلة على أدوات مدمجة لقياس δP(f) (على سبيل المثال، أدوات زيوريخ المدمجة في LabOne a Frequency Sweeper31). بعد قياس RIN للحزم ، قم بإيقاف تشغيل الليزر وقياس الضوضاء الإلكترونية (أي RIN المحسوبة دون أي ضوء على أجهزة الكشف).ملاحظة: شريطة أن يكون RIN محدودا بتقلبات الليزر وليس بضوضاء الطلقة ، سيساعد هذا القياس المظلم في تشخيص الأجهزة المستخدمة في القياسات ؛ إذا كانت الضوضاء الإلكترونية عالية مثل RIN لليزر ، فلا يمكن استخدام ذلك لقياس RIN الخاص بالليزر ؛ قد يلزم استخدام مكبرات الصوت منخفضة الضوضاء للغاية لتقليل الضوضاء الإلكترونية. إذا كان RIN محدودا بضوضاء اللقطة وليس بتقلب الليزر ، فقم بتسليط المزيد من الطاقة البصرية على الكاشف. انظر الشكل 8. 3. إعداد الكشف الطيفي لتصوير SRS توجيه المضخة وعوارض ستوكس إلى المجهر. ضع العينة التي تمت مناقشتها في القسم 1 ، وابحث عن منطقة بدون خرز للمساعدة في محاذاة شعاع المضخة. باستخدام الكاميرا، قم بقياس المظهر الجانبي المنعكس لشعاع ستوكس (المضخة) أثناء حجب المضخة (ستوكس). اضبط مواضع بقع الليزر باستخدام المرايا أمام المجهر مباشرة.ملاحظة: للحصول على أعلى جيل SRS ، يجب أن تتداخل تماما. يوضح الشكل 9 (أ) المضخة، (ب) ستوكس، و (ج) كلا الحزمتين متداخلتين تماما عند المستوى البؤري للمجهر. اجعل أهداف الإثارة والجمع مختلطة.ملاحظة: يعني استخدام الأهداف المصححة بلا نهاية أن تركيز المضخة على مستوى العينة سيؤدي إلى شعاع متجمع في الفتحة الخلفية لهدف التجميع. ضع مرشحا قصيرا لإزالة Stokes المعدل وتوجيه شعاع المضخة إلى الصريف. ضع عدسة بعد الصريف لتركيز الشعاع المشتت على أجهزة الكشف.ملاحظة: ستساعد معادلة الصريف في تحديد التشتت الخطي (أي عدد النانومتر لكل مم في مستوى الكاشف باستخدام عدسة ذات بعد بؤري معين f32). ترتبط معادلة الصريف بدورية الأخدود d للصريف ، وزاوية الحدوث α ، وزاوية الحيود β ، والطول الموجي المنحرف λ ، وترتيب الحيود m (Eq [2]). (2) للكشف المتوازن ، قم بقياس طيف المرجع والنسخ المتماثلة للإشارة التي تنتشر على طول شعاع المضخة.ملاحظة: الملامح المكانية لشعاع المضخة بعد الصريف هي خط يضم المكونات الطيفية المختلفة لمضخة النطاق العريض على طولها. سيتم تركيز كل مكون طيفي من خط المضخة على المسافة f بواسطة عدسة كروية (انظر الخطوات 3.1-3.2). لتجنب قطع المضخة المشتتة ، ضع العدسة الكروية في أقرب مكان ممكن من الصريف. ضع PBS مباشرة بعد العدسة الكروية لفصل النسخ المتماثلة للمضخة.ملاحظة: هنا ، تم استخدام مقسم شعاع مكعب الاستقطاب لأن هذا النوع من المستقطب لا يتدافع استقطاب شعاع المضخة. كما أنه يفصل بشكل فعال بين النسخ المتماثلة المختلفة للمضخة ويمكن أن يكون كبيرا بما يكفي لتجنب قطع مضخة النطاق العريض. سيعكس PBS نسخة الإشارة المتماثلة (s-polarized) وينقل النسخة المتماثلة المرجعية (p-polarized). باستخدام زوج من مرايا التوجيه ، قم بتوجيه الإشارة والإشارة إلى أجهزة الكشف الخاصة بها (الشكل 1).ملاحظة: في التكوين المتوازن المثالي، يجب أن يكون للإشارة والنسخ المتماثلة المرجعية نفس الطاقة البصرية. لإزالة الضوضاء في شعاع المضخة، قم بربط قنوات مصفوفة الصمام الثنائي الضوئي التي تقيس الإشارة بنظيراتها في الكاشف المرجعي. وبالتالي ، تأكد من أن الصمام الثنائي الضوئي nth للإشارة ومصفوفات الصمام الثنائي الضوئي المرجعي يقيس القوة البصرية لنفس المكون الطيفي للإشارة والنسخ المتماثلة المرجعية.ملاحظة: يوضح الشكل 8 أطياف RIN المثالية. لضمان المطابقة الطيفية بين صفيفتي الصمام الثنائي الضوئي ، ضع شقا صغيرا أو قزحية بين الصريف و PBS لتصفية المضخة المشتتة مكانيا. قم بقص جميع المكونات الطيفية للنسخ المتماثلة للمضخة باستثناء مكون واحد لتوسيط الأشعة المرسلة على كاشف nth لمصفوفات الصمام الثنائي الضوئي المرجعية والإشارة. استخدم مرايا التوجيه المذكورة لضبط ارتباط قنوات الكشف المختلفة. عند هذه النقطة، ابدأ الفحص المجهري SRS. للقيام بذلك ، قم بتعديل Stokes ، والمسح النقطي للعينة ، والحصول على نقل التشكيل على طيف المضخة (ΔI) مع طيف DC المقابل (I) للحصول على طيف SRS (ΔI / I) العادي من كل بكسل. قم بإنتاج مصفوفات ثلاثية الأبعاد تحتوي صفوفها (x) وأعمدتها (y) على المواضع الممسوحة ضوئيا للعينة. على كل متجه (z) متعامد على المستوى x-y ، قم بتخزين طيف SRS.ملاحظة: يوضح الشكل 12 بنية البيانات فوق الطيفية SRS. اضبط قوة شعاع ستوكس على 65 ميجاوات وقوة شعاع مضخة النطاق العريض على 20 ميجاوات. حدد وقت تكامل مثالي للتجارب.ملاحظة: هنا ، كان وقت التكامل 44 ميكروثانية. ومع ذلك ، كان وقت سكن البكسل 1 مللي ثانية بسبب الماسح الضوئي بيزو البطيء. 4. القياسات الكيميائية لبيانات SRS فائقة الطيف استخدم تحليل دقة المنحنى متعدد المتغيرات لفك تشابك المكونات الكيميائية المختلفة للعينة. قم بتنزيل واجهة المستخدم الرسومية من الرابط الموجود في Tauler و de Juan و Jaumot33.ملاحظة: هنا ، تم استخدام برنامج matlab متعدد المتغيرات دقة منحنى المربعات الصغرى بالتناوب (MCR-ALS) التي طورها Tauler وزملاؤه في العمل34,35. لتطبيقات MCR-ALS على بيانات SRS ، راجع 36,37 ؛ للاطلاع على مناقشات مفصلة حول الخوارزمية، راجع 38. في MATLAB ، أعد تشكيل مكعب البيانات الفائقة الطيف SRS إلى مصفوفة D مع صفوفها التي تحتوي على أطياف SRS. افترض أن المكعب الفائق SRL D غير المطوي هو مزيج خطي من التركيز C والملامح الطيفية S للمكونات الكيميائية للعينة (أي D = CS T + E ، حيث E عبارة عن مصفوفة تحتوي على الخطأ التجريبي ، ويشير الحرف المرتفع T إلى تبديل المصفوفة). احصل على المكونات الرئيسية للبيانات لفصل C و S. كما هو معروف مسبقا أن العينة التي نوقشت في القسم 1 تحتوي على أربعة أنواع ، وهي DMSO وزيت الزيتون و PMMA و PS ، قم بتكوين البرنامج للبحث عن أربعة أنواع بالإضافة إلى نوع آخر لحساب ضوضاء الخلفية. إذا كانت هناك عينة مختلفة بها عدد أكبر أو أقل من الأنواع ، فقم بتكوين البرنامج وفقا لذلك.ملاحظة: يقوم البرنامج بتحلل البيانات الطيفية ذات القيمة المفردة ، واستخدامها كتخمينات أولية للأطياف النقية S. بدلا من ذلك ، قم بتغذية البرنامج بمصفوفة تحتوي على الآثار الطيفية المعروفة (على سبيل المثال ، أطياف رامان التلقائية للمواد).ملاحظة: باستخدام التقديرات الأولية للأطياف النقية، سيقوم البرنامج بحساب C = DS(S T S)−1 و S T = ( C T C)−1 C T D. تم تحسين القيم الجديدة ل C و S باستخدام خوارزمية المربعات الصغرى بالتناوب. نظرا لأن SRS هي إشارة غير سالبة ، فقم بتقييد خوارزمية المربعات الصغرى المتناوبة لتقديم قيم إيجابية فقط.ملاحظة: سيسمح C و S المحسنة بإنشاء مصفوفة جديدة D * = CST ، وهي مجموعة بيانات سيقارنها البرنامج بالبيانات الأصلية D. يقوم البرنامج تلقائيا بتكرار هذه الخطوات حتى يكون الفرق بين D* و D أقل من قيمة عتبة عشوائية يمكن تعريفها. مخطط C و S للحصول على صور كيميائية وأطياف مميزة للمكونات الكيميائية للعينة.

Representative Results

يوضح الشكل 3 النتائج المثالية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول باستخدام PS و PMMA وزيت الزيتون. سيؤدي دوران LBO1 هذا إلى تغيير معامل الانكسار الذي يعاني منه حقل SHG ، مما يعدل سرعة طوره مباشرة. عندما تتطابق سرعة الطور لحقل SHG مع سرعة الاستقطاب غير الخطي المستحث في LBO1 ، فإن الحقل المتولد غير الخطي والاستقطاب غير الخطي سيكونان في طور ، مما يؤدي إلى إشعاع SHG مكثف. بمعنى آخر ، سيسمح تعديل الزاوية φ ل LBO1 للمستخدم بتحقيق حالة مطابقة الطور المثالية ل SHG. عند استخدام بلورة مطابقة للمرحلة من النوع الأول هنا ، سيكون استقطاب شعاع SHG متعامدا مع استقطاب الحزمة الأساسية (الشكل 5B). ويبين الشكل 8 معدل RIN للمصادر البصرية المستخدمة في هذا البروتوكول والحد الأقصى لضوضاء اللقطة، وهو نتيجة للطبيعة الكمومية للإلكترونات والفوتونات التي تضع حدا أساسيا لضوضاء الليزر. يتم حساب RIN المحدود لضوضاء اللقطة كما هو موضح في Eq (3). (3) حيث h هو ثابت بلانك ، و ν هو التردد البصري. وبالتالي ، توفر ضوضاء اللقطة إرشادات مفيدة لتصميم الإلكترونيات. ويبين الشكل 11 ألف والشكل 11 جيم بيانات نموذجية لأطياف متوازنة وغير متوازنة. بطبيعة الحال ، تؤثر آثار الكشف المتوازن على النتائج النهائية للتجارب ، أي الخرائط الكيميائية. ويبين الشكل 11 باء والشكل 11 دال صورا مركبة في ظروف غير متوازنة ومتوازنة، على التوالي. سيساعد التنفيذ الناجح للبروتوكول الموصوف على تحديد وتوطين المكونات الكيميائية المختلفة لعينة غير متجانسة واستخراج أطياف SRS المميزة لها. إن إخضاع البيانات الطيفية الفائقة للشكل 12 للتحليل الكيميائي يعطي الشكل 13. ويبين الشكل 13 ألف مركبا من خرائط التركيز لمختلف المكونات الكيميائية للعينة، بينما يبين الشكل 13 باء أطياف SRS المميزة لها. لاحظ أن البيانات الموضحة في الشكل 13A لا تسمح للمستخدم بتحديد المكونات المختلفة للعينة بسهولة فحسب ، بل تسمح أيضا بإجراء المزيد من التحليل الكمي. على سبيل المثال ، باستخدام خرائط التركيز ، يمكننا حساب متوسط التركيز الجزئي لكل نوع كيميائي: 38٪ DMSO ، 25٪ PMMA ، 14٪ PS ، و 22٪ زيت الزيتون. الشكل 1: مخطط مجهر SRS عريض النطاق المستخدم في هذا البروتوكول. الاختصارات: PBSx = مقسم الحزم المستقطب. SHG = وحدة الجيل التوافقي الثانية ؛ OPO = المذبذب البارامتري البصري ؛ AOM = المغير البصري الأكوستو; SPF = مرشح التمرير القصير; M-LIA: مضخم صوت قفل متعدد القنوات ؛ DM = مرآة ثنائية اللون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: أطياف مضخة النطاق العريض القابلة للضبط (الأزرق) وحزم ستوكس ضيقة النطاق (الحمراء). الشكل 3: صورة برايتفيلد للعينة غير المتجانسة كيميائيا. لاحظ أن الفحص المجهري التقليدي لا يسمح بتمييز المكونات المختلفة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: PS = البوليسترين; PMMA = بولي ميثيل ميثاكريلات; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تعديل نبضات ستوكس ضيقة النطاق . (أ) يظهر التتبع الأزرق الشفاف الشعاع المنحرف 0، بينما يظهر المقياسالأسود الترتيب 1 المقابل . (ب) الإعداد البصري لتحسين كفاءة التشكيل للشعاع المنحرفمن الدرجة 1 وصقل حجم بقعة شعاع ستوكس قبل الوصول إلى هدف الإثارة. الاختصارات: AOM = المغير البصري الأكوستو; fx = البعد البؤري للعدسة X. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: العمليات البصرية غير الخطية المطلوبة لدفع OPO . (أ) هندسة تفاعل SHG. فوتونان أساسيان عند ω1 ينقلان نظام المواد إلى مستوى افتراضي عالي الطاقة ، حيث يقفز نظام المواد إلى الحالة الأرضية ، وينبعث منه فوتون عند ωSHG. (ب) مخطط تجربة مجموعة المساعدة الإنسانية. (ج) مخطط لإعدادات مجموعة SHG و OPO. (د) هندسة تفاعل DFG. ينقسم فوتون ωSHG إلى فوتونات الإشارة (ωSignal) والفوتونات الخاملة (ωIdler). يتم تحقيق كسب شعاع الإشارة عن طريق تغذية فوتونات الإشارة وجعلها يتردد صداها في التجويف. (ه) مخطط تجربة DFG. الاختصارات: SMx = مرآة كروية (R = 75 مم) ؛ OPO = المذبذب البارامتري البصري ؛ SHG = وحدة الجيل التوافقي الثانية ؛ DFG = توليد التردد المختلف; LBO = ثلاثي الليثيوم. OC = مكثف الزيت. DM = مرآة ثنائية اللون ؛ fx = البعد البؤري للعدسة X. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 6: هندسة ضاغط المنشور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 7: توليد مجموع التردد لتحسين التداخل الزماني المكاني . (أ) SFG بين المضخة وستوكس و SHG الخاص بكل منهما يصطدم على الشاشة. هنا ، ركزت العدسة المضخة وعوارض ستوكس على الكريستال ، بينما قام مرشح منخفض التمرير بإزالتها. (ب) شدة SFG بين المضخة وستوكس كدالة للتأخير الزمني. قم بتعيين الوقت صفر لإعداد SRS في الموضع الذي يزيد من SFG. يرجع عدم تناسق الارتباط المتقاطع في B إلى المظهر الزمني الذي يسببه etalon على شعاع ستوكس. الاختصارات: SFG = توليد مجموع الترددات; SHG = وحدة الجيل التوافقي الثانية ؛ SRS = تحفيز التحليل الطيفي لتشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: أطياف رين. يظهر النطاق المميز باللون الأخضر أفضل منطقة طيفية لتجارب SRS. يضمن تعديل شعاع ستوكس على أي تردد داخل هذا النطاق أن تكون تأثيرات ضوضاء الليزر على إشارة SRS هي أدنى مستوى ممكن. الاختصارات: RIN = ضوضاء الكثافة النسبية. SRS = تحفيز التحليل الطيفي لتشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: ملامح الحزمة . (أ) مضخة، (ب) ستوكس، و (ج) مضخة وستوكس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: الهندسة المفترضة لصريف التشتت وكاشف صفيف الصمام الثنائي الضوئي. الشكل 11. آثار الكشف المتوازن. التأثيرات على الأطياف (A، C) والصور الكيميائية (B، D). المركبات المعروضة في اللوحتين (B) و (D) هي النتائج النهائية للتجارب (أي بعد التحليل الكيميائي للبيانات فوق الطيفية). انظر قسم البروتوكول 4 للحصول على التفاصيل). أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. اختصار: SRS = تحفيز التحليل الطيفي لتشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 12: مكعب تمثيلي SRS تم الحصول عليه باستخدام مجهر SRS عريض النطاق. تخزن الطائرة x-y إحداثيات المواضع الممسوحة ضوئيا ، بينما يسجل كل متجه على طول z طيف SRS. اختصار: SRS = تحفيز التحليل الطيفي لتشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 13: التحليل الكيميائي لبيانات SRS فائقة الطيف . (أ) مركب من خرائط التركيز لمختلف مكونات العينة. (ب) الأطياف المميزة للأنواع الكيميائية. في كلتا اللوحتين ، الأصفر: زيت الزيتون ، الأزرق: DMSO ، السماوي: PS ، والبرتقالي: PMMA. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (A). الاختصارات: SRS = تحفيز التحليل الطيفي لتشتت رامان. PS = البوليسترين; PMMA = بولي ميثيل ميثاكريلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الفحص المجهري SRS عريض النطاق هو تقنية تصوير قوية توفر تباينا كيميائيا حقيقيا لتحديد المكونات الكيميائية لعينة غير متجانسة وفك تشابكها. يمكن أن تكون إمكانات هذه الأداة التحليلية مفيدة للعديد من المجالات البحثية ، بدءا من علوم المواد إلى علم الأنسجة المرضية. الجانب السلبي للفحص المجهري SRS عريض النطاق هو حقيقة أنه يتطلب تقنيا. لا يتطلب التجريبيون فقط الدراية الفنية بمصادر الليزر عريضة النطاق ، بل يحتاجون أيضا إلى التعامل مع نبضات الليزر لتوليد SRS بكفاءة ، وهي إشارة تحتاج بدورها إلى قياسها باستخدام مخططات كشف متطورة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يصف سير العمل لإنتاج خرائط كيميائية للمركبات الكيميائية المختلطة باستخدام مجهر SRS عريض النطاق متعدد الإرسال. على الرغم من أن العمل الموصوف قد يكون تافها بالنسبة لبعض فيزيائيي الليزر والمجهريين غير الخطيين ، فقد لا يكون الأمر كذلك بالنسبة للقراء المهتمين بفوائد الفحص المجهري SRS عريض النطاق الذين توجد معرفتهم العلمية خارج هذه المجالات. لذلك ، كنا نهدف إلى تفصيل كل خطوة لتوجيه الجمهور الواسع المهتمين بالفحص المجهري SRS عريض النطاق.

بدأ البروتوكول المطروح بإظهار كيفية تحضير عينة بسيطة ولكنها غنية طيفيا تتكون من العديد من مبعثرات رامان القوية والمعروفة. ناقشنا كيفية الحصول على مضخة النطاق العريض وحزم ستوكس ضيقة النطاق اللازمة لإنشاء مجهر SRS. ويبين الشكل 5 جيم مخططا لإعدادات SHG وOPO. لاحظ أن العدسة f 1 تركز الشعاع الأساسي على LBO₁ لتوليد SHG ، بينما تعكس المرآة ثنائية اللون إشعاع SHG وتنقل الحزمة الأساسية المتبقية. تقوم عدسة ثانية f₂ بتجميع شعاع SHG. وبما_أنf 2 > f 1، يتم توسيع شعاع SHG بعامل يساوي f₂/f₁. تركز العدسة الثالثة f₃ شعاع SHG الموسع على بلورة LBO ثانية من النوع الأول (LBO₂) مقطوعة عند θ = 90 درجة و φ = 29.0 درجة. من خلال ضخ LBO 2 مع SGH المذكور أعلاه (520 نانومتر) ، سيظهر الإشعاع داخل نطاق 680-910 نانومتر من LBO₂ من خلال توليد تردد الاختلاف (DFG) ، مما ينتج حزمتين: الإشارة والخمول²⁷ (الشكل 5D ، E). يتم التخلص من هذا الأخير بينما يتم تضخيم الأول في تجويف OPO لتوصيل نبضات المضخة المستخدمة في تجارب SRS. لا ينبغي الخلط بين مضخة OPO عند 520 نانومتر ، أي شعاع SHG ، ومضخة تجارب SRS (أي شعاع إشارة OPO).

ينشأ التباين في المجهر SRS من إشارة غير خطية يتم إنشاؤها في النقطة البؤرية للمجهر ، وهي إشارة تتطلب حصر عدد كبير من الفوتونات في مستوى العينة في وقت معين. يتم تحقيق حبس الفوتون هذا باستخدام هدف مجهر ذو فتحة عددية عالية (NA) ، وهو مجموعة من العدسات التي تحدد أيضا الدقة المكانية للنظام: كلما ارتفع NA ، زادت الدقة المكانية. ومع ذلك ، فإن أهداف NA العالية معبأة بكثافة بالزجاج ، مما يدخل GDD الإيجابي للإشعاع النبضي ، وهو زقزقة تردد توسع في النهاية المظهر الزمني للنبضات³⁹. وبالتالي، فإن GDD الذي أدخله هدف المجهر قد يزيد من مدة نبضات مضخة النطاق العريض، مما يجعله أطول من المغلف الزمني ستوكس ويقلل من عرض النطاق الترددي الفعال الذي يمكن الوصول إليه لإشارة رامان. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي هذا التوسع أيضا إلى تشويه الملامح الطيفية لطيف SRS المقاس.

في CARS، تظهر الإشارة ذات الصلة طيفيا بأطوال موجية تختلف عن تلك الموجودة في حقول الإثارة. يمكن استخدام أنبوب مضاعف ضوئي بسيط أو كاميرا جهاز مقترن بالشحن (CCD) لدمج إشارة CARS في الوقت المناسب ، مما يلخص الآلاف من النبضات لمتوسط ضوضاء الليزر. بدلا من ذلك ، تظهر إشارة SRS كنقل تعديل باهت مضمن في خلفية ليزر قوية ومتقلبة. نظرا لأن هذا التعديل ضعيف ، يمكن لضوضاء الليزر أن تطغى عليه بسهولة ، مما يقلل من سرعة التصوير وحساسية مجهر SRS. لذلك ، قبل التصوير ، من الضروري قياس ضوضاء الكثافة النسبية (RIN) لتحديد ما إذا كان الليزر مناسبا لتصوير SRS عالي السرعة وتحديد تردد التشكيل بأقل ضوضاء. يتم تعريف RIN على أنه الكثافة الطيفية لقدرة الضوضاء [δP (f) ، مع وحدات W² / Hz] لليزر التي يتم تطبيعها بواسطة متوسط الطاقة البصرية ()^40,41. وبعبارة أخرى ، يصف RIN تقلبات الليزر الطبيعية بترددات مختلفة (Eq [4]).

(4)

وبالتالي ، فإن RIN هي معلمة لنظام SRS تحدد نطاق تردد التشكيل المثالي للتجارب. على سبيل المثال ، يوضح شريط الزيتون في الشكل 8 نطاق تردد التشكيل المثالي لتصوير SRS. في حالة SRS ضيقة النطاق ، يجب على المستخدم قياس RIN لكل من المضخة و Stokes لاختيار الشعاع الذي يحتاج إلى تعديل لتحقيق الأداء الأمثل. لاحظ من الشكل 8 ، على سبيل المثال ، أن شعاع ستوكس يحتوي على RIN أعلى قليلا من المضخة ، مما يعني أن قياسات SRG ستتحول إلى أكثر ضوضاء من نظيراتها SRL. في حالة SRS عريض النطاق ، فإن الشعاع الذي يجب تعديله هو شعاع النطاق الضيق.

يعبر التشتت الزاوي D للصريف عن زاوية الحيود كدالة للطول الموجي ، ويتم تعريفه على أنه مشتق من معادلة الصريف. بالنسبة لتكوين Littrow ، يتم إعطاء التشتت الزاوي بواسطة Eq (5).

(5)

للحصول على Eq (5) ، افترضنا α = β ، وحلنا Eq (2) ل m / d وأدخلنا النتيجة في d β / d λ. لاحظ أنه في تكوين Littrow ، β = ^sin-1 (m λ / 2 d). ضمن تقريب الزاوية الصغيرة ، يكون التغير في الموضع على طول الطيف fdβ ≈ dl (الشكل 10). وبالتالي ، من خلال إدخال dβ في Eq (5) ، يمكننا حساب التشتت الخطي ، وهي كمية بوحدات nm ^mm-1 باستخدام Eq (6):

(6)

بالنسبة لصريف الحيود الذي يعمل في تكوين Littrow مع 1,851.85 أخدود / مم ، d = 540 نانومتر. إذا استخدمنا حيود الضوء من الدرجة الأولى عند ~ 789 نانومتر ، فإن D = 0.0027 rad nm-1. باستخدام عدسة f = 750 مم ، نحصل على تشتت خطي ≈ 0.5 نانومتر مم-1 ، مما يترجم إلى ≈ 7.8 سم – 1 مم – 1 مم ^{– 1}. وبالتالي ، يحدد البعد البؤري للعدسة “كثافة” nm لكل مم في مستوى الكاشف: كلما طالت البعد البؤري ، قل عدد nm لكل مم تم الحصول عليه ، مما زاد من المسافة بين الخطوط الطيفية لمضخة النطاق العريض. على العكس من ذلك ، مع الأطوال البؤرية الأقصر ، سيكون هناك المزيد من نانومتر لكل مم في مستوى الكاشف ، مما يقلل من المساحة التي تشغلها المضخة المشتتة.

يعمل الكشف المتوازن على تحسين جودة الصورة وحساسية الإعدادات الصاخبة. على سبيل المثال ، وفقا لأطياف RIN الموضحة في الشكل 8 وبالنظر إلى SRS النموذجي بسعة 1 × ^10-5 ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء غير المتوازنة (SNR) هي ≈60. باستخدام الكشف المتوازن (أي بالقرب من ضوضاء اللقطة) ، من الممكن تحقيق SNR من ≈145. ويبين الشكل 11 الأطياف والصور المركبة في ظل ظروف متوازنة وغير متوازنة. بطبيعة الحال ، تؤثر آثار الكشف المتوازن على النتائج النهائية للتجارب ، أي الخرائط الكيميائية. بدعم من هذه النتائج ، نؤكد أن الكشف المتوازن هو تقنية قوية لمواجهة الآثار الضارة لتقلبات الليزر على جودة الصورة. تجدر الإشارة إلى أن الكشف المتوازن هو الأنسب لأشعة الليزر الصاخبة ، مثل مذبذبات الألياف. قد لا تتطلب مجاهر SRS التي تعمل بمصادر ضوء بصرية هادئة (مثل ليزر الحالة الصلبة) اكتشافا متوازنا.

يشرح البروتوكول أيضا نهجا يعتمد على البصريات غير الخطية للعثور على التداخل الزماني المكاني بين نبضات هذه الحزم. وصفنا مزايا استخدام 1^st بدلا من ترتيب الحيود 0^th ل AOM كشعاع ستوكس المعدل. علاوة على ذلك ، تم وصف الآثار الضارة للتشتت على كفاءة توليد SRS مع اقتراحات بطرق للتخفيف منها عبر ضاغط منشور. بالإضافة إلى ذلك ، يشرح البروتوكول كيفية محاذاة المنشور ويسلط الضوء على ثلاثة جوانب حاسمة يجب مراعاتها لتحقيق الأداء الأمثل. نحن لا نناقش فقط أهمية RIN للفحص المجهري SRS ولكن أيضا نعرض كيفية قياسه باستخدام مضخم صوت قفل ، ومع طيف RIN ، نحدد أفضل تردد للتشكيل. مع مثال ملموس ، تشرح هذه الورقة كيف تساعد معادلة الصريف في تصميم سلسلة الكشف. وأخيرا ، يوضح البروتوكول ، مع بيانات SRS الحقيقية ، بنية SRS hypercube وكيفية تحليلها باستخدام لغة برمجة علمية مستخدمة تقليديا.

يحتوي هذا البروتوكول على ثلاثة قيود طفيفة. أولا، يتكون مخطط الكشف المستخدم في هذه المساهمة من كاشف قفل غير تقليدي متعدد القنوات صممه وبناه Sciortino et al.26 وكما هو موضح سابقا^{في 25}، يمكن استبدال هذا الكاشف بصمام ثنائي ضوئي متوازن جاهز. على الرغم من أن هذا التعديل يتعلق فقط بالكاشف ويترك البروتوكول دون تغيير تقريبا ، مع صمام ثنائي ضوئي واحد ، يحتاج المرء إلى مسح كل مكون طيفي على الكاشف بدلا من قياسها جميعا في وقت واحد. ثانيا ، يستخدم هذا البروتوكول كشفا متوازنا مضمنا ، مما يتطلب إدخال العديد من العناصر البصرية في مسار الحزمة. تزيد هذه العناصر البصرية من تعقيد النظام وتؤدي إلى فقدان الطاقة البصرية وتوسيع النبض.

يتطلب الكشف المتوازن المضمن أيضا أن تمر نسختا المضخة المتماثلتان عبر العينة ، وهي حالة قد لا تكون مثالية للعينات الحساسة للضوء ، مثل الخلايا الحية ، أو للعينات ثنائية الانكسار القوية التي قد تواجه فيها نسختا المضخة المتماثلتان خصائص بصرية مختلفة ، وبالتالي إلغاء الكشف المتوازن. ثالثا ، يعتمد البروتوكول على OPO محلي الصنع ، وهو جهاز قد لا يكون متاحا بسهولة. ومع ذلك ، فإن بدائل أطياف النطاق العريض التي يقدمها OPO هي الاستمرارية الفائقة من الألياف البصرية غير الخطية أو البلورات السائبة. لا يمكن استخدام هذا الأخير إلا مع ليزر معدل التكرار المنخفض (حتى 5 ميجاهرتز). وبالتالي ، كما هو الحال مع كل تصميم تجريبي ، فإن البروتوكول في متناول اليد لديه بعض القيود. ومع ذلك ، فهي ضئيلة ولا تعرض للخطر نجاح هذا النهج.

على الرغم من وصف عينة مرجعية هنا ، إلا أن هذا البروتوكول يمكن أن يفصل بنجاح الأنواع الكيميائية داخل الخلايا والأنسجة الحيوانية والنباتية ، مثل السليلوز أو الأنواع الدهنية أو البروتينات ، وإيجاد تطبيقات عملية في مهام كيميائية حيوية مختلفة أو كأداة تشخيص في علم الأنسجة المرضية. وبالمثل ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة قيمة في علوم المواد. على سبيل المثال ، بعد هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يستجوب التركيب الجزيئي وتركيز الأنواع البوليمرية⁴². وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية متوافقة مع تقنيات الفحص المجهري غير الخطي الأخرى، مثل الفحص المجهري عريض النطاق القائم على مسبار المضخة⁴³ و CARS⁴⁴ غير المتجانس، وعمليات الخلط رباعية الموجات التي، كما هو الحال مع SRS، تتطلب أيضا حزمتين ضوئيتين مثيرتين وقياسات نقل التشكيل. وأخيرا، يمكن تطبيق بعض المعلومات الواردة في هذه الورقة على تقنيات التصوير غير الخطي التي لا تعتمد على تقنيات نقل التحوير، ولكنها تتطلب محاذاة اثنين أو أكثر من أشعة الليزر النبضية، مثل CARS⁴⁵ التقليدي والفحص المجهري SFG⁴⁶.

باختصار ، يصف هذا البروتوكول منهجية قوية تستند إلى الفحص المجهري SRS عريض النطاق لاستخراج الخرائط الكيميائية وأطياف SRS المميزة لها من مخاليط غير متجانسة كيميائيا ، مما يوفر مجموعات بيانات تسمح بتحليل البيانات الكمية المباشرة. كما أن براعة وبساطة الطريقة تعطي القارئ المهتم إمكانية تكييفها مع التقنيات غير الخطية المختلفة.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر د. ب. بالتمويل المقدم من مشروع الاتحاد الأوروبي CRIMSON بموجب اتفاق المنحة رقم 101016923 ومشروع منطقة لومبارديا NEWMED بموجب اتفاق المنحة رقم بور FESR 2014-2020. G. C. تقر بالتمويل المقدم من مشروع الاتحاد الأوروبي GRAPHENE Core3 بموجب اتفاقية المنحة رقم 881603. كما تعترف G. C. بالتمويل المقدم من جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية ، رقم جائزة المنحة: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

Riferimenti

Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
Cheng, J. X., Xie, X. S. . Coherent Raman scattering microscopy. , (2012).
Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
Blume, R. J. Boxcar” integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer’s guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , (2021).
Palmer, C., Loewen, E. G. . Diffraction grating handbook. , (2005).
. Multivariate curve resolution homepage Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021)
Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. . Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , (2020).
Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.&#34 Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021)
Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).