זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

יתוש הטיגריס האסייתי Aedes albopictus (Skuse) (דיפטרה: Culicidae), שהוא וקטור מפתח של נגיף הדנגי (DENV) באסיה ובחלקים אחרים של העולם¹, הוא מארח טבעי של שני סוגים של החיידקים התוך תאיים, וולבצ’יה (wAlbA ו-wAlbB), המופצים לאורך קו הנבט והרקמה הסומטית ^2,3. קו התאים Aa23 שמקורו בעוברי A. albopictus מורכב משני סוגי תאים מורפולוגיים לפחות, שניהם תומכים בזיהום⁴ וניתן לרפא אותם מזיהום וולבצ’יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה (Aa23-T). בהתחשב בכך ש- Aa23 שומר רק על wAlbB, זהו מודל שימושי לחקר אינטראקציות פונדקאי-אנדוסימביונט ^4,5,6.

וולבצ’יה מועברת באופן אימהי ומדביקה כ-65% ממיני החרקים ^8,9 ו-28% ממיני היתושים^{בני 10}. הוא מדביק מגוון רקמות ויוצר מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארח, בדרך כלל גורם לחוסר תאימות ציטופלסמית (CI)¹¹ ולהחלפת אוכלוסייה על ידי מניפולציה של מערכת הרבייה המארחת ^12,13. תגובות פונדקאיות אלה נצפו באוכלוסיות טבעיות של דרוזופילה סימולנס¹⁴ וב-A. aegypti בכלוב מעבדה ובניסוי שדה¹⁵. מניפולציה לא-רבייתית חשובה שנוצרה על ידי וולבצ’יה היא עמידות מארח מושרית למגוון פתוגנים, כולל DENV, נגיף צ’יקונגוניה (CHIKV) ונגיף הנילוס המערבי (WNV)^16,17, שעשוי להיות מתווך על ידי מערכת חיסונית מולדת משופרת של הסימביונט^18,19, תחרות בין וולבצ’יה לנגיפים על משאבים מארחים חיוניים²⁰, ומניפולציה של מסלולי הגנה נגיפיים מארחים²¹ .

פרוטוקול זה פותח לחקר המנגנונים הבסיסיים האלה של תגובות אנטי-ויראליות של פונדקאי המושרה על-ידי וולבצ’יה. הוא משתמש בארבע שיטות לגילוי של זיהום וולבצ’יה תוך תאי של תאי Aa23. שיטות אלה מספקות בסיס תיאורטי חזק למחקרים על זיהום וולבצ’יה תוך-תאי של מינים מארחים אחרים. השיטה הראשונה, PCR – טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הגברה אנזימטית של אזורים ספציפיים בדנ”א מבלי להשתמש בהליכי שיבוט קונבנציונליים – שימשה לאיתור דנ”א של וולבצ’יה ולקבוע את נוכחותו/היעדרו של זיהום וולבצ’יה ²². השיטה השנייה מודדת את צפיפות העתקת הדנ”א של וולבצ’יה באמצעות PCR כמותי (qPCR) לזיהוי ומדידה אמינים של מוצרים שנוצרו במהלך כל מחזור PCR, אשר פרופורציונלי ישירות לכמות התבנית לפני PCR²³. השיטה השלישית מזהה נוכחות של חלבוני וולבצ’יה תוך-תאיים, תוך שימוש בכתם מערבי – אחד הכלים החזקים ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בתערובות מורכבות על ידי שילוב של כוח ההפרדה הגבוה של אלקטרופורזה, הספציפיות של נוגדנים ורגישות של תגובות אנזימטיות כרומוגניות. השיטה הסופית היא בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA) המשלבת אימונולוגיה, ביוכימיה ומיקרוסקופיה כדי לזהות את חלבון פני השטח של וולבצ’יה (wsp) באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדן כדי לאשר את הספיגה התאית של וולבצ’יה ולקבוע את לוקליזציה התאית שלה.

מאמר זה מתאר את ארבע השיטות המפורטות לעיל כדי לאמת את קיומה של וולבצ’יה בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם וולבצ’יה האקסוגנית עברה בהצלחה טרנספקציה והוולבצ’יה בתא נוקתה. לאחר קביעה אם וולבצ’יה קיימת בתאים או לא, ניתן לבצע מגוון ניתוחים שונים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מטבוליקה. פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי של וולבצ’יה באמצעות תאי Aa23, אך ניתן להשתמש בו גם בתאים אחרים.