Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia
Summary
A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.
Abstract
Imunidade herdada descreve como alguns animais podem passar a “memória” de uma infecção anterior para seus filhos. Isso pode aumentar a resistência ao patógeno em sua descendência e promover a sobrevivência. Embora a imunidade herdada tenha sido relatada em muitos invertebrados, os mecanismos subjacentes a este fenômeno epigenético são amplamente desconhecidos. A infecção de Caenorhabditis elegans pelo patógeno microsporidiano natural Nematocida parisii resulta nos vermes que produzem descendentes que são robustamente resistentes à microsporidia. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade intergeracional no modelo de infecção n . parisii –C. elegans simples e geneticamente tratável. O artigo atual descreve métodos para infectar C. elegans e gerar descendentes imuno-primed. Métodos também são dados para avaliar a resistência à infecção por microsporidia, por meio da coloração de microsporidia e da visualização da infecção por microscopia. Em particular, a imunidade herdada impede a invasão de células hospedeiras por microsporidia, e a fluorescência na hibridização in situ (FISH) pode ser usada para quantificar eventos de invasão. A quantidade relativa de esporos de microsporidia produzidos na prole imuno-primed pode ser quantificada pela coloração dos esporos com um corante de ligação de quitina. Até o momento, esses métodos lançaram luz sobre a cinética e a especificidade do patógeno da imunidade herdada, bem como os mecanismos moleculares que a subjacente. Essas técnicas, ao lado das extensas ferramentas disponíveis para a pesquisa de C. elegans , permitirão importantes descobertas no campo da imunidade herdada.
Introduction
A imunidade herdada é um fenômeno epigenético pelo qual a exposição dos pais a patógenos pode permitir a produção de descendentes resistentes a infecções. Esse tipo de memória imunológica tem sido mostrado em muitos invertebrados que não possuem sistemas imunológicos adaptativos e podem proteger contra doenças virais, bacterianas e fúngicas1. Embora a imunidade herdada tenha implicações importantes para entender a saúde e a evolução, os mecanismos moleculares subjacentes a essa proteção são amplamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque muitos dos animais em que a imunidade herdada foi descrita não são organismos modelo estabelecidos para pesquisa. Em contraste, estudos no nematode transparente Caenorhabditis elegans se beneficiam de um extenso kit de ferramentas genéticas e bioquímicas 2,3, um genoma altamente anotado 4,5, e um curto tempo de geração. De fato, a pesquisa em C. elegans permitiu avanços fundamentais nos campos da epigenética e imunidade inata 6,7, e agora é um modelo estabelecido para estudar a memória imunológica 8,9.
Microsporidia são patógenos fúngicos que infectam quase todos os animais e causam infecções letais em humanos imunocomprometidos10. A infecção começa quando um esporo de microsporidia injeta ou “dispara” seu conteúdo celular (sporoplasma) em uma célula hospedeira usando uma estrutura chamada tubo polar. A replicação intracelular do parasita resulta na formação de meronts, que acabam se diferenciando em esporos maduros que podem sair da célula11,12. Embora esses parasitas sejam prejudiciais tanto para a saúde humana quanto para a segurança alimentar, ainda há muito a aprender sobre sua biologia de infecção12. Nematocida parisii é um parasita microsporídano natural que se replica exclusivamente nas células intestinais dos vermes, resultando em redução da fecundidade e, em última instância, morte. O modelo de infecção N. parisii –C. elegans tem sido usado para mostrar: (1) o papel da autofagia no desembaraço do patógeno13, (2) como a microsporidia pode sair das células infectadas nãoapenas 14, (3) como os patógenos podem se espalhar de célula para célula formando sincronia15, (4) as proteínas N. parisii usam para interagir com seu hospedeiro16, e (5) a regulação da resposta transcricional de patógenos intracelulares (IPR)17, 18 anos.
Os protocolos para a infecção de C. elegans são descritos no trabalho atual e podem ser usados para revelar a biologia única da microsporidia e dissecar a resposta do hospedeiro à infecção. A microscopia de vermes fixos manchados com o corante de tingitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra a propagação da infecção de esporos de microsporidia contendo quitina em todo o intestino. A coloração DY96 também permite a visualização de embriões de vermes contendo quitina para a avaliação simultânea da gravididade do verme (capacidade de produzir embriões) como uma leitura da aptidão do hospedeiro.
Trabalhos recentes revelaram que C. elegans infectados com N. parisii produzem descendentes que são robustamente resistentes à mesma infecção19. Esta imunidade herdada dura uma única geração e é dependente de doses, pois descendentes de pais mais fortemente infectados são mais resistentes à microsporidia. Curiosamente, os filhotes de N. parisii também são mais resistentes ao patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, embora não estejam protegidos contra o vírus natural orsay19. O presente trabalho também mostra que a prole imuno-preparada limita a invasão de células hospedeiras por microsporidia. O método também descreve a coleção de descendentes imuno-primed e como o PEIXE pode ser usado para detectar N. parisii RNA em células intestinais para avaliar a invasão celular hospedeira e o disparode 20 esporos.
Juntos, esses protocolos fornecem uma base sólida para o estudo da microsporidia e imunidade herdada em C. elegans. Espera-se que o trabalho futuro neste sistema modelo permita importantes descobertas no campo nascente da imunidade herdada. Essas técnicas também são susceptíveis de ser pontos de partida para investigar a imunidade herdada induzida pela microsporídia em outros organismos hospedeiros.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve o estudo da microsporidia e da imunidade herdada em um modelo de infecção n. parisii-C. elegans simples e geneticamente tratável.
A preparação do esporo é um protocolo intensivo que normalmente produz esporos suficientes para 6 meses de experimentos, dependendo da produtividade24. É importante ressaltar que a infectividade deve ser determinada para cada novo esporo “lote” antes de usá-lo para os experimentos. Devid…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Winnie Zhao e Yin Chen Wan por fornecer comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant #522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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