Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion
Summary
Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.
Abstract
Vererbte Immunität beschreibt, wie einige Tiere das “Gedächtnis” einer früheren Infektion an ihre Nachkommen weitergeben können. Dies kann die Resistenz von Krankheitserregern in ihren Nachkommen erhöhen und das Überleben fördern. Während bei vielen wirbellosen Tieren eine vererbte Immunität berichtet wurde, sind die Mechanismen, die diesem epigenetischen Phänomen zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den natürlichen mikrosporidianen Erreger Nematocida parisii führt dazu, dass die Würmer Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen Mikrosporidien sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der intergenerationellen Immunität im einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C . elegans Infektionsmodell. Der aktuelle Artikel beschreibt Methoden zur Infektion von C. elegans und zur Erzeugung von immungrundierten Nachkommen. Es werden auch Methoden zur Bestimmung der Resistenz gegen Mikrosporidieninfektionen durch Färbung auf Mikrosporidien und Visualisierung der Infektion durch Mikroskopie gegeben. Insbesondere verhindert die vererbte Immunität die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien, und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann zur Quantifizierung von Invasionsereignissen verwendet werden. Die relative Menge an Mikrosporidiensporen, die bei den immungrundierten Nachkommen produziert werden, kann quantifiziert werden, indem die Sporen mit einem Chitin-bindenden Farbstoff gefärbt werden. Bis heute haben diese Methoden Aufschluss über die Kinetik und die Spezifität der vererbten Immunität sowie die ihr zugrunde liegenden molekularen Mechanismen gegeben. Diese Techniken, zusammen mit den umfangreichen Werkzeugen, die für die Forschung von C. elegans zur Verfügung stehen, werden wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen.
Introduction
Die vererbte Immunität ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem die elterliche Exposition gegenüber Krankheitserregern die Produktion von infektionsresistenten Nachkommen ermöglichen kann. Diese Art von Immungedächtnis wurde bei vielen wirbellosen Tieren gezeigt, denen ein adaptives Immunsystem fehlt und die vor viralen, bakteriellen und Pilzerkrankungen schützen können1. Während die vererbte Immunität wichtige Auswirkungen auf das Verständnis von Gesundheit und Evolution hat, sind die molekularen Mechanismen, die diesem Schutz zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Dies liegt zum Teil daran, dass viele der Tiere, bei denen eine vererbte Immunität beschrieben wurde, keine etablierten Modellorganismen für die Forschung sind. Im Gegensatz dazu profitieren Studien am transparenten Fadenwurm Caenorhabditis elegans von einem umfangreichen genetischen und biochemischen Toolkit2,3, einem stark annotierten Genom 4,5 und einer kurzen Generationszeit. Tatsächlich hat die Forschung in C. elegans grundlegende Fortschritte auf den Gebieten der Epigenetik und der angeborenen Immunitätermöglicht 6,7, und es ist jetzt ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Immungedächtnisses 8,9.
Mikrosporidien sind pilzliche Krankheitserreger, die fast alle Tiere infizieren und bei immungeschwächten Menschen tödliche Infektionen verursachen10. Die Infektion beginnt, wenn eine Mikrosporidiensporie ihren Zellinhalt (Sporoplasma) in eine Wirtszelle injiziert oder “feuert”, indem sie eine Struktur verwendet, die als Polröhre bezeichnet wird. Die intrazelluläre Replikation des Parasiten führt zur Bildung von Meronten, die sich letztendlich in reife Sporen differenzieren, die die Zelleverlassen können 11,12. Während diese Parasiten sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Ernährungssicherheit schädlich sind, gibt es noch viel über ihre Infektionsbiologiezu lernen 12. Nematocida parisii ist ein natürlicher mikrosporidianer Parasit, der sich ausschließlich in den Darmzellen von Würmern repliziert, was zu einer verminderten Fruchtbarkeit und letztendlich zum Tod führt. Das N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell wurde verwendet, um zu zeigen: (1) die Rolle der Autophagie bei der Pathogen-Clearance 13, (2) wie Mikrosporidien infizierte Zellen nicht-lytisch verlassen können 14, (3) wie sich Krankheitserreger von Zelle zu Zelle ausbreiten können, indem sie Synzytie15 bilden, (4) die Proteine, die N. parisii verwendet, um mit seinem Wirt 16 zu interagieren, und (5) die Regulation der transkriptionellen intrazellulären Pathogenantwort (IPR)17, 18.
Protokolle für die Infektion von C. elegans sind in der aktuellen Arbeit beschrieben und können verwendet werden, um die einzigartige Mikrosporidienbiologie aufzudecken und die Reaktion des Wirts auf eine Infektion zu sezieren. Die Mikroskopie von fixierten Würmern, die mit dem Chitin-bindenden Farbstoff Direct Yellow 96 (DY96) angefärbt sind, zeigt die Infektionsausbreitung von Chitin-haltigen Mikrosporidiensporidien im Darm. Die DY96-Färbung ermöglicht auch die Visualisierung von Chitin-haltigen Wurmembryonen zur gleichzeitigen Beurteilung der Wurmschwerkraft (Fähigkeit, Embryonen zu produzieren) als Auslesung der Wirtsfitness.
Jüngste Arbeiten haben ergeben, dass C. elegans , die mit N. parisii infiziert sind, Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen die gleiche Infektionsind 19. Diese vererbte Immunität dauert eine einzige Generation und ist dosisabhängig, da Nachkommen von stärker infizierten Eltern resistenter gegen Mikrosporidien sind. Interessanterweise sind N. parisii-grundierte Nachkommen auch resistenter gegen den bakteriellen Darmpathogen Pseudomonas aeruginosa, obwohl sie nicht gegen den natürlichen Erreger Orsay-Virus19 geschützt sind. Die vorliegende Arbeit zeigt auch, dass immungrundierte Nachkommen die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien begrenzen. Die Methode beschreibt auch die Sammlung von immungrundierten Nachkommen und wie FISH verwendet werden kann, um N. parisii-RNA in Darmzellen nachzuweisen, um die Invasion von Wirtszellen und das Abfeuern von Sporen20 zu untersuchen.
Zusammen bieten diese Protokolle eine solide Grundlage für die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität bei C. elegans. Es ist zu hoffen, dass zukünftige Arbeiten in diesem Modellsystem wichtige Entdeckungen auf dem im Entstehen begriffenen Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen werden. Diese Techniken sind wahrscheinlich auch Ansatzpunkte für die Untersuchung der mikrosporidieninduzierten vererbten Immunität in anderen Wirtsorganismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität in einem einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell.
Die Sporenpräparation ist ein intensives Protokoll, das in der Regel genügend Sporen für 6 Monate Experimente liefert, abhängig von der Produktivität24. Wichtig ist, dass die Infektiosität für jede neue Sporen-“Menge” bestimmt werden muss, bevor sie für die Exper…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Winnie Zhao und Yin Chen Wan für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691) unterstützt.
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
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