الكلاب العضوية المعوية في نظام دعم ثنائي الغرفة نفاذية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يصف ثقافة المواد العضوية المعوية للكلاب في نظام دعم مزدوج الحجرة وقابل للنفاذ. يتم وصف البذر العضوي في الدعامات القابلة للنفاذ ، وصيانة الطبقة الأحادية ، وتجارب نفاذية الدواء اللاحقة.
Abstract
يستخدم نظام الدعم القابل للنفاذ عادة بالاقتران مع خطوط الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) كأداة في المختبر لتقييم النفاذية الفموية للأدوية العلاجية المرشحة الجديدة. ومع ذلك ، فإن استخدام خطوط الخلايا التقليدية هذه له قيود ، مثل التعبير المتغير عن التقاطعات الضيقة ، والتمايز الجزئي للخلايا ، وغياب المستقبلات النووية الرئيسية. على الرغم من أوجه القصور هذه ، فإن نماذج Caco-2 و MDCK مقبولة على نطاق واسع ويتم التحقق من صحتها للتنبؤ بالنفاذية الفموية البشرية في الجسم الحي .
الكلاب هي نموذج انتقالي ذي صلة للبحوث الطبية الحيوية بسبب أوجه التشابه بينها في تشريح الجهاز الهضمي والبكتيريا المعوية مع البشر. وبناء على ذلك، ودعما لتطوير الأدوية الموازية، فإن وضع أداة فعالة ودقيقة في المختبر للتنبؤ بخصائص نفاذية الدواء في الجسم الحي سواء في الكلاب أو البشر أمر مرغوب فيه للغاية. يمكن أن تكون هذه الأداة هي النظام العضوي المعوي للكلاب ، الذي يتميز بهياكل ظهارية ثلاثية الأبعاد (3D) ، مجمعة ذاتيا مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة.
يصف بروتوكول بذر الدعم المنفذ (1) الطرق التجريبية لفصل وبذر عضويات الكلاب في الإدراجات. تم وصف عزل الكلاب العضوية وثقافتها وحصادها سابقا في مجموعة منفصلة من البروتوكولات في هذا العدد الخاص. تتم مناقشة طرق الصيانة العامة للطبقة الأحادية العضوية المعوية للكلاب بدقة في بروتوكول الصيانة (2) أحادي الطبقة. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طرق تقييم السلامة الهيكلية للطبقة الأحادية عبر قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) والمجهر الضوئي. وأخيرا، يصف البروتوكول التجريبي (3) للنفاذية المهام التي تسبق التجربة مباشرة، بما في ذلك التحقق من صحة النتائج التجريبية في المختبر .
بشكل عام ، يتغلب نموذج الكلاب العضوي ، جنبا إلى جنب مع تقنية زراعة الخلايا ثنائية الغرفة ، على القيود المرتبطة بالنماذج التجريبية 2D ، وبالتالي تحسين موثوقية التنبؤات بالنفاذية الفموية الواضحة للأدوية العلاجية المرشحة لكل من الكلاب والمريض البشري.
Introduction
تستخدم أنظمة الدعم القابلة للنفاذ عادة لتحديد النفاذية الواضحة للأدوية العلاجية المرشحة من خلال الحاجز الظهاري المعوي 1,2. ويمكن أيضا استخدامها لتقييم الإفراز الخلوي3 ، وهجرة الخلايا4 ، وسمية المخدرات5. تعد فحوصات نفاذية الدواء عن طريق الفم في المختبر خطوة رئيسية في عملية اكتشاف الأدوية وتطويرها2 ، حيث يتم اختبار الأدوية المرشحة الفردية في المرحلة المبكرة من دورة حياة البحث والتطوير للدواء6. نظام الدعم النافذ هو جهاز زراعة خلايا ثنائي الغرفة يتكون من إدراج مع غشاء شبه مسامي يوضع في صفيحة متعددة الآبار. يسمح هذا النظام بالوصول المباشر إلى الجوانب القمية والقاعدية للخلية أحادية الطبقة المزروعة في الإدراج7. عادة ما يتم اشتقاق الطبقة الأحادية المستخدمة في هذه الأنظمة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية (على سبيل المثال ، خط الخلايا الغدية لسرطان القولون والمستقيم البشري Caco-2)8. تنمو مزارع الخلايا في حالة استقطاب تحاكي البنية الدقيقة الطبيعية للخلايا الظهارية المعوية ، مما يتيح المزيد من التمايز الخلوي ، والتشريح الدقيق المماثل والوظيفة7. يمكن العثور على تفاصيل إدراج الدعم القابل للنفاذ في الشكل 1. إن بذر الإدخالات ذات مزارع الخلايا 2D ، التي تستخدم تقليديا لتقييم نفاذية الدواء المعوي ، ميسور التكلفة نسبيا وسهل الاستزراع9. تقدم هذه الأنظمة العديد من القيود الرئيسية ، بما في ذلك قدرتها المحدودة على التنبؤ بالتمثيل الغذائي المعوي للأدوية العلاجية المرشحة10,11. وينطبق هذا على جميع آليات امتصاص الأدوية، سواء كان ذلك الامتصاص السلبي من خلال التقاطعات الضيقة بين الخلايا الظهارية، أو الامتصاص النشط عبر الظهارة من خلال التدفق السائل، أو ناقلات الامتصاص (على سبيل المثال، البروتين السكري P، ناقل أحادي الكربوكسيلات 1)، والأدوية التي يتم استقلابها بواسطة الخلايا المعوية.
تشترك الكلاب في بيئة مشتركة ونظام غذائي مشترك مع البشر12. يشبه تشريح الكلاب المعوية وتكوين الميكروبيوم إلى حد كبير تشريح البشر13 ، والذي يعزى إلى التدجين والوجبات الغذائية المشتركة على مدى السنوات ال 36000 الماضية14. لسوء الحظ ، يمكن أن تكون أوجه التشابه هذه أيضا أسبابا / محفزات شائعة لتطوير المرض. تصاب الكلاب بأمراض مزمنة مماثلة للبشر ، مثل السمنة 15 ، ومرض التهاب الأمعاء 16 ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي 17 ، والورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) 18 ، والعديد من الأمراض الأخرى المرتبطة بطول عمرها النسبي 19. وبناء على ذلك، يمكن استخدام عضويات الكلاب بنجاح في إجراء بحوث انتقالية عكسية لهذه الأمراض المزمنة المتعددة العوامل بروح مبادرة الصحة الواحدة20.
خلايا Caco-2 هي خطوط الخلايا الأكثر استخداما لمقايسات امتصاص الدواء عن طريق الفم21. تعتبر هذه الخلايا حاليا نموذج “المعيار الذهبي” لاختبارات نفاذية الأمعاء في المختبر 2،22،23. يعبر خط خلايا Caco-2 عن ناقلات التدفق والامتصاص الموجودة في الأمعاء البشرية ، على الرغم من اختلاف مستويات التعبير24،25،26. تستخدم خلايا Caco-2 أيضا على نطاق واسع كنماذج لتحديد ما إذا كان الدواء ركيزة أو مثبطا لناقلات التدفق المعوي22,27. على الرغم من أن خلايا Caco-2 هي من أصل القولون ، إلا أنها تحاكي خلية الخلايا المعوية. لسوء الحظ ، لا تمثل خلايا Caco-2 سوى نوع خلية واحد من الطبقة الظهارية للأمعاء الدقيقة9 ، والتي تفشل في تلخيص تكوين نوع الخلايا الظهارية المعوية المعقدة بدقة. على سبيل المثال ، تغيب الخلايا الكأسية المخصصة لإنتاج المخاط عن مزارع Caco-2 بحيث لا يمكن تقييم التفاعلات المخاطية الدوائية دون الزراعة المشتركة مع خطوط الخلايا الأخرى28. علاوة على ذلك ، لا تعبر ثقافات Caco-2 عن العديد من المستقبلات النووية المهمة الموجودة عادة في الأمعاء ، مثل مستقبلات pregnane X (PXR) ، ومستقبلات الستيرويد X (SXR) ، ومستقبلات androstane التأسيسية (CAR)29. ونتيجة لذلك، تفشل ثقافات الكاكو-2 في نمذجة تحريض ناقلات الأدوية والإنزيمات بواسطة بعض الأدوية التي تحفز هذه المستقبلات (مثل ريفامبين)30.
تعالج تقنية العضوية المعوية 3D بعض هذه القيود19. المواد العضوية هي تركيبات ذاتية التجميع مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة التي يمكن إنشاؤها من عينات الأنسجة التي يتم حصادها باستخدام تقنيات microinvasive20. يتم استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان لنماذج نفاذية الأمعاء31,32. توفر عضويات الكلاب بديلا ذا صلة بالمواد العضوية البشرية لأن أبحاث الخلايا الجذعية البشرية مقيدة بالقضايا الأخلاقية33. علاوة على ذلك ، توفر الكلاب العضوية نظاما في المختبر لاستكشاف نفاذية أدوية الكلاب ، والتمثيل الغذائي ، والنقل النشط ، والتفاعلات بين الأدوية والعقاقير. لمعالجة هذه الفجوة التكنولوجية ، تم وصف النمو المتسق والموثوق به للعضويات المعوية للكلاب في نظام دعم قابل للنفاذ34. قد يتنبأ فحص النفاذية مع المواد العضوية المعوية للكلاب بنفاذية الأمعاء للكلاب والتمثيل الغذائي لجزيئات الأدوية الصغيرة مقارنة بالمقايسات المستخدمة حاليا (Caco-2). إن تأكيد هذه الميزات المحورية يضفي هذا النظام الجديد في المختبر على العمل المستقبلي لاستكشاف التأثير المحتمل للمحفزات على التمثيل الغذائي داخل الخلايا والنقل النشط.
تتكون عضويات الكلاب من جميع أنواع الخلايا الموجودة عادة في الطبقة الظهارية للأمعاء. من وجهة نظر وظيفية وتشريحية دقيقة ، فإنها تكرر بشكل موثوق بيئة الطبقة الظهارية لأمعاء الكلاب19,35. علاوة على ذلك ، فإن وجود المخاط ، وناقلات الأدوية والإنزيمات الخاصة بالكلاب ، والتمايز الخلوي العام في الأعضاء المعوية للكلاب يمكن مقارنته بما شوهد في الجسم الحي في الكلاب34. وبالتالي ، يمكن عزل المواد العضوية من المرضى البيطريين المرضى واستخدامها لنمذجة تأثير عمليات المرض المختلفة (على سبيل المثال ، التهاب الأمعاء المزمن) على نفاذية الدواء عن طريق الفم الكلاب19,36. يمكن أيضا استخدام نظام العضوية المعوية للكلاب في إعدادات أخرى غير تجارب نفاذية الدواء. يمكن أيضا عزل هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد عن المرضى المرضى كما وصفها سابقا تشاندرا وآخرون لمرض التهاب الأمعاء ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي ، والورم اللحمي المعدي المعوي19.
يصف بروتوكول بذر الدعم المنفذ طرقا لإنشاء مزارع عضوية معوية للكلاب في الإدراجات. يحدد هذا البروتوكول الأول طرقا لفصل ثقافات الكلاب العضوية القائمة المطلية في مصفوفة الغشاء خارج الخلية. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة الطلاء المسبق للإدخالات بالكولاجين I ومصفوفة الغشاء خارج الخلية في هذا البروتوكول. كما يتم وصف تضمين عضويات الكلاب في إدراج الدعم القابل للنفاذ بالتفصيل.
البروتوكول الثاني هو بروتوكول صيانة الطبقة الأحادية ، والذي يتضمن الصيانة العامة للكلاب العضوية 3D المطلية في إدراج. يتم عرض تواتر وأحجام الوسائط العضوية المستخدمة لتحديث الثقافة ، وطرق منع تلف زراعة الخلايا ، في هذا البروتوكول الثاني ، إلى جانب الطرق التجريبية لتقييم التقاء الطبقة الأحادية الظهارية.
أخيرا ، يركز البروتوكول التجريبي للنفاذية على طرق لتحديد ما إذا كانت عضويات 3D المعوية للكلاب في فحص النفاذية جاهزة للاستخدام التجريبي وخطوات التحقق اللازمة قبل إجراء أي تجربة. يصف هذا القسم أيضا الإعداد والتنفيذ الناجح لتجربة النفاذية ، إلى جانب حضانة وأخذ عينات من الأدوية العلاجية المرشحة في غرف ثقافة الطبقة الأحادية. ويناقش أيضا استخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسين منخفضة النفاذية (FITC-dextran) لمراقبة سلامة الطبقة الأحادية. أخيرا ، يتم وصف طريقة تقييم في المختبر للتحقق من صحة النتائج بعد الانتهاء من التجربة. تجارب النفاذية هي موضوع واسع للغاية ويتم تلخيصها بشكل جيد للغاية من قبل Hubatsch et al.37. ويرد في الشكل 2 موجز لسير عمل البروتوكولات.
الشكل 1: عضويات الكلاب المعوية على نظام دعم قابل للنفاذ. يتم وضع ملحق الدعم القابل للنفاذ في بئر من لوحة 24 بئرا. يسمح الغشاء المسامي الدقيق ببذر المواد العضوية المعوية للكلاب المنفصلة ، وستشكل هذه الخلايا في النهاية طبقة أحادية العضوية 2D. تسمح هذه التقنية بالوصول إلى جانبي AP و BL من الطبقة الأحادية. يتم إدخال الوسط العضوي في كل من غرف AP و BL للدعم القابل للنفاذ. يتم توضيح امتصاص (AP→BL) وإفراز (BL→AP) للدواء المرشح ، بالإضافة إلى طريقتين محتملتين لنقل المخدرات. الاختصارات: AP = قمي; BL = القاعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير عمل بروتوكولات الدعم العضوية النفاذة للكلاب. يتم طلاء إدراج الدعم القابل للنفاذ مسبقا بمزيج من مصفوفة الغشاء خارج الخلية والكولاجين I ويتم تحضينه لمدة 1 ساعة. أثناء عملية الحضانة ، يتم فصل الثقافة العضوية. يتم زرع الخلايا العضوية الفردية في الإدراج ، ويضاف الوسط في الغرفة القاعدية الجانبية مباشرة بعد البذر ، بينما يضاف الوسط إلى الغرفة القمية بعد 24 ساعة من انتهاء عملية البذر. تشمل صيانة ومراقبة المواد العضوية تغييرات متوسطة منتظمة ، وقياسات قيمة TEER ، والفحص المجهري الضوئي لتقييم سلامة الطبقة الأحادية. قبل التجربة ، يجب تمييز المواد العضوية عن طريق إزالة مثبطات ROCK و GSKiβ من الوسائط. يتم قياس قيم TEER في يوم التجربة ، ويتم فحص الطبقة الأحادية العضوية عبر المجهر الضوئي بحثا عن تلف الخلايا. ثم يتم استبدال الوسط بمخزن مؤقت مناسب واحتضانه قبل التجربة. يتم استخدام فحص FITC-dextran أثناء تجارب نفاذية الأمعاء39 كعلامة على سلامة الطبقة الأحادية. يتم أخذ قياسات TEER بعد التجربة ، وسيقوم الفحص المجهري الضوئي بالتحقق من صحة النتائج بعد 24 ساعة. الاختصارات: TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة. ROCK = كيناز مرتبط ب rho; GSKiβ = الجليكوجين سينثاز كيناز بيتا; F = التألق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد مزارع الكلاب العضوية المعوية في جهاز الدعم القابل للنفاذ مفهوما فريدا يربط بين اختبارات نفاذية الدواء التقليدية40 ورواية في نموذج الكلاب المختبري 41. يمكن استخدام أنواع مختلفة من المواد العضوية المعوية للكلاب وتقييمها بناء على الهدف من التجربة مع الحد الأدنى من التعديلات. يوصى باختبار تركيزات متعددة من الدواء ذي الأهمية في 3-4 آبار لكل مجموعة. قد تستند التركيزات إلى التركيز المعوي المتوقع للدواء. علاوة على ذلك ، قد يساعد استخدام الأبحاث السابقة في تحديد النقاط الزمنية المناسبة لتصميم الدراسة. يجب إجراء التوثيق المناسب لتصميم الدراسة لزيادة قابلية التكرار والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
هذه التكنولوجيا لديها العديد من القيود بسبب حداثة الطريقة42 ، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم وجود توحيد في التصميم التجريبي وتنفيذ البروتوكول عبر المختبرات. وقد اعترفت المجموعات الأخرى43 بهذا النقص في التوحيد القياسي، وستؤدي بروتوكولات الكلاب أحادية الطبقة العضوية ثلاثية الأبعاد إلى إمكانية التكرار بين المختبرات وإدخال التوحيد القياسي على هذا النظام. تعمل النهج الموحدة لتحليل البيانات على تحسين قابلية التكرار ويمكن أن تعزز نتائج اختبار المخدرات الأولي باستخدام عضويات الكلاب في نظام الدعم القابل للنفاذ عبر المختبرات المختلفة. يفتقر نموذج الكلاب العضوي ثلاثي الأبعاد أيضا إلى مجموعات البيانات التي تقارن في المختبر P قيمتطبيق الأدوية النموذجية بامتصاص الأمعاء البشري أو الكلاب في الجسم الحي ، مثل خلايا Caco-244,45,46. بمجرد إنشاء هذه البيانات ، يمكن استخدام هذا النموذج العضوي للكلاب لتقييم نفاذية الأمعاء أثناء تطوير الدواء.
من الأهمية بمكان توخي الحذر عند بذر المواد العضوية على نظام الدعم النافذ لزرع كثافة عالية بما فيه الكفاية من الخلايا المنفصلة بشكل مناسب. تكون قيم TEER للنظام أكثر موثوقية وقابلة للتكرار عند زراعتها في طبقات أحادية صارمة. يمكن أن تؤدي الثقافة المطولة للطبقات الأحادية إلى زيادة هائلة في قيم TEER التي تصل إلى أبعد من القيم الفسيولوجية للأمعاء. ثم تظهر أقسام H & E من هذه الهياكل 3D عدة طبقات من الخلايا فوق بعضها البعض مع هياكل متغيرة من الخلايا المعوية أقرب إلى الغشاء.
بعد التوسع الناجح في الطبقة الأحادية العضوية المعوية للكلاب ، يمكن تحليل النتائج بنفس طريقة مقايسات الخلايا 2D التقليدية عن طريق حساب معامل النفاذية الظاهر للدواء (Papp) الصيغة44. تصف قيمةتطبيق P (انظر Eq (2)) معدل النقل عبر الطبقة الأحادية الخلوية47.
(2)
هو الميل الأولي للتركيز مقابل منحنى الوقت (على سبيل المثال ، نانومول / ثانية). A هي مساحة الإدراج (سم2) ، و C0 هي التركيز الأولي للدواء أو المركب في غرفة المتبرع37. يعد الاعتراف الموثوق به بسلامة الطبقة الأحادية جزءا مهما من اختبار النفاذية الذي يتطلب التوحيد القياسي. يوصى بإجراء الفحص المجهري الضوئي وقياسات TEER لتقييم عضويات الكلاب في نظام دعم قابل للنفاذ والمساعدة في تحديد التوقيت الصحيح للتجربة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علامات النفاذية الجزيئية الصفرية (على سبيل المثال ، FITC-dextran ، أصفر لوسيفر ، PEG-400) لتقييم سلامة الطبقة الأحادية العضوية وظيفيا. يجب الانتباه إذا كان المركب الذي تم اختباره متأثرا بالناقل. يستخدم P-glycoprotein (P-gp) كمثال شائع لمضخة التدفق السائل. يجب إنشاء نسبة تدفق النفايات السائلة (P app ، BL-AP / Papp ، AP-BL) مقارنة بركيزة مسبارP-GP المعروفة.
المجهر الضوئي (عادي أو محسن مع تباين الطور) هو طريقة لا تقدر بثمن للتحقق من سلامة الطبقة الأحادية 2D أو 3D وإدراج المرشح أثناء تقييم النمو الزائد الخلوي المحتمل. يمكن أن يكون الشكل 7 بمثابة دليل للتعرف على مزارع الخلايا العضوية المعوية الصحية للكلاب. قيم TEER هي مقياس مهم لتشكيل التقاطعات بين الخلايا والتمايز بين الثقافات العضوية في ظهارة معوية سليمة. تتمايز الخلايا العضوية المعوية للكلاب إلى خلايا معوية وخلايا كأسية (الشكل 6). تسمح هذه الخلايا المنتجة للمخاط بدراسة تفاعلات الدواء والمخاط ، والتي كان من الصعب تحقيقها باستخدام مزارع الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد48. تم تأكيد وجود خلايا الغدد الصماء المعوية سابقا في الخلايا العضوية المعوية للكلاب بواسطة Chandra et al.33.
يتم توفير مزيد من التوصيف للطبقات الأحادية العضوية للكلاب المشتقة من المواد العضوية الصائم واللفائفي والقولوني باستخدام TEM. تظهر صور TEM البنية الدقيقة الخلوية ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة وتشكيل الزغابات الدقيقة ، مما يوضح بشكل أكبر تعقيد وفائدة هذه النماذج العضوية في الطب الانتقالي. استنادا إلى النتائج التجريبية ، كانت الثقافات العضوية على الدعم القابل للنفاذ جاهزة للتجريب بين الأيام 11 واليوم 13 بعد البذر (الشكل 9). تراوحت قيم TEER في هذه المرحلة الزمنية بين 1,500 و 2,500 Ω.cm2. تستمر مرحلة الهضبة لقيم TEER لفترة زمنية محدودة للغاية حيث يجب بدء التجربة قبل أن تبدأ قيم TEER في الانخفاض ببطء. يمكن أن تكون قيم TEER أيضا جزءا حاسما من عرض النتائج التجريبية المهمة حيث قد تتفاعل بعض الأدوية أو سواغات المنتجات الدوائية مع الطبقة الأحادية (على سبيل المثال ، التقاطعات الضيقة) ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قراءات قيمة TIER. هذا وحده يمكن أن يكون بمثابة بيانات لتجربة.
يمكن تطبيق المواد العضوية المعوية للكلاب في جهاز زراعة الخلايا ثنائي الغرفة في مجالات أخرى غير نفاذية الدواء عن طريق الفم بسبب البنية الفريدة للطبقة الأحادية الناتجة عن الخلية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامها في أبحاث علم الأحياء الدقيقة (على سبيل المثال ، تأثير تغيير النباتات الميكروبية GI) ، ودراسات امتصاص الفيروسات ، والتفاعلات الدوائية الدوائية ، وآليات نقل الأدوية49. عادة ما تمتلئ غرفة المتبرع بعقار الاختبار أو المركب الذي تختاره ، ويتم أخذ الاقتباسات من غرفة الاستقبال في نقاط زمنية مختلفة. يمكن تحليل هذه الأليكوتوغرافيا باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو قياس الطيف الكتلي ، أو فحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو تقنيات أخرى لتحديد الكمية والسرعة التي يتخلل بها المذاب من خلال الطبقة الأحادية.
تتطلب هذه الدراسات طبقة أحادية سليمة لتقييم نفاذية الدواء بدقة. وهذا يتطلب عادة زراعة طبقات أحادية اللون تتجاوز تلك اللازمة لحساب الآبار غير الصالحة للاستخدام. يمكن أيضا استخدام الطبقات الأحادية للخلايا العضوية لقياس الامتصاص الفيروسي إما من الجانب القمي أو القاعدي للطبقة الأحادية ، مع قراءات تشمل مقايسات التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة للكشف عن الامتصاص الخلوي للفيروس. وأخيرا، يمكن تطبيق عقاقير متعددة (أي الركيزة والمثبطات) على غرفة المتبرع لتحديد التفاعلات الدوائية القائمة على الناقل.
واستنادا إلى الملاحظات الحالية، لن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق فقط على الكلاب العضوية في إدراج المستزرعة، ولكنها ستكون مناسبة أيضا للأنواع البيطرية الأخرى وأنظمة الأعضاء، مع الحاجة إلى تعديلات طفيفة لتناسب الأنواع أو نموذج الأعضاء الذي تختاره على أفضل وجه. كان لا بد من تعديل بروتوكولات النمو العضوي المعوي للكلاب بناء على الخصائص الفريدة للثقافة. وبالتالي ، يمكن تعديل البروتوكول إلى نوع آخر ولكنه سيتطلب تغييرات طفيفة على البروتوكول. قد تبدأ التعديلات بتغييرات في كثافة بذر الخلايا وتتوسع إلى تغييرات في تكوين الوسائط للتمييز بشكل صحيح بين المواد العضوية ذات الاهتمام.
يعد التوحيد القياسي والتوثيق التفصيلي للإجراءات التجريبية والرصد المتسق للطبقات الأحادية للخلية ممارسات حاسمة مطلوبة عبر اختبارات الدعم القابلة للنفاذ ولا تقتصر على نظام الكلاب. هذه الأنواع المحتملة أو تعديلات الأعضاء حاسمة للتوثيق والإبلاغ عن المزيد من التقدم في هذا المجال. يحتوي هذا النموذج على العديد من القيود ، على سبيل المثال ، متطلبات التكلفة ، والتباين بين المختبرات ، والبيانات المحدودة حول القدرة على التنبؤ بامتصاص الأمعاء في الجسم الحي. الكلاب ، في بعض الحالات ، تمتلك ناقلات أدوية مختلفة وإنزيمات استقلاب من البشر50.
علاوة على ذلك ، يجب اختبار نظام الكلاب العضوي على مجموعة متنوعة من الأجهزة الأخرى ثنائية الغرفة من الشركات المصنعة الأخرى لتحديد مدى ملاءمة مثل هذا النموذج (على سبيل المثال ، يجب تحديد مدى ملاءمة تركيبات غشاء المرشح المختلفة). عيب آخر هو أن جزء تجربة نفاذية الدواء من المخطوطة أقل وصفية من الأجزاء السابقة. يحدث هذا بسبب وجود فائض من المعلومات في هذا المجال. كان الهدف من هذا الجزء من المخطوطة هو وصف هذه الأساليب بطريقة قابلة للتعديل مع عدم قطع حواف الركائز الأساسية لهذه التجارب. تم جمع معلومات أكثر تفصيلا عن تجارب النفاذية بواسطة Hubatsch et al.37. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الإدخالات القابلة للنفاذ في تجارب الزراعة المشتركة وهجرة الخلايا وفحص الغزو4.
في الختام ، فإن المواد العضوية المعوية للكلاب في أجهزة الاستزراع ثنائية الغرفة لديها القدرة على استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك المجالات الطبية الحيوية والطب الانتقالي ، على سبيل المثال لا الحصر. تنشئ البروتوكولات العديد من الاستراتيجيات لتخطيط تجربة وتعزيز موثوقية البيانات بين المختبرات للنماذج العضوية عبر مجال علم الأحياء.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن امتناننا لمختبر التشخيص البيطري لموظفي جامعة ولاية أيوا ، وهم هالي لامبرت ، إميلي راهي ، روزالين برانامان ، فيكتوريا غرين ، وجنيفر غرولتز ثراش ، لمعالجة العينات في الوقت المناسب. نود أيضا أن نشكر جودي سميث وبيثان فالنتاين على توفير المواد لتجارب النفاذية. نود أيضا أن نشكر ديفيد دياز ريغان على مساعدته في الشكل 9. باستثناء الشكل 6 ، تم إنشاء جميع الأرقام في BioRender.com. يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من بدء تشغيل أعضاء هيئة التدريس ، وجائزة ISU VPR Miller ، وجائزة ISU VPR Miller ، والجائزة الفرعية NSF SBIR إلى ISU # 1912948.
Materials
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
Riferimenti
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
