Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

As modificações pós-translacionais (PTMs) são um mecanismo importante no que diz respeito à regulação da proteína, essencial para a homeostase celular. A ubiquidade proteica é uma modificação dinâmica e intrincada que cria uma variedade de diferentes sinais resultando em vários desfechos celulares em organismos eucarióticos. A ubiquização é um processo reversível que consiste na fixação de uma proteína de ubiquitina contendo 76 aminoácidos ao substrato, ocorrendo em uma cascata enzimática composta por três reações distintas¹. O primeiro passo é caracterizado pela ativação da ubiquitina, que depende de uma hidrólise ATP para formar uma oniquitina ligada a tioéster de alta energia entre a ubiquitina C-terminus e o resíduo de cisteína presente no local ativo da enzima E1. Posteriormente, a ubiquitina é transferida para a enzima E2 formando um complexo de tiaster com a ubiquitina. Posteriormente, a ubiquitina é covalentemente ligada ao substrato pelo E2, ou mais frequentemente, pela enzima E3, que reconhece e interage com o substrato ^2,3. Ocasionalmente, enzimas E4 (fatores de alongamento da cadeia ubiquitina) são necessárias para promover o conjunto da cadeia multiubiquitina³.

A ubiquitina possui sete resíduos de linfino (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), permitindo a formação de cadeias de poliugentina que geram ligações distintas para produzir diferentes estruturas tridimensionais que serão reconhecidas por várias proteínas^{efeitoras 4,5}. Assim, o tipo de cadeia de poliuforma introduzida no substrato é essencial para decidir seu destino celular ^6,7,8. Além disso, o substrato também poderia ser ubiquitinado através de seus resíduos n-terminais chamados N-degrons. As ubiquína-ligases específicas E3 são responsáveis pelo reconhecimento de N-degron, permitindo a poliuubiquização do resíduo de liseína^nas proximidades 9.

Atualmente, há mais de 40 substratos específicos do SCF caracterizados. Entre elas, podem ser encontrados 10,11,12,13, ^12,13. Assim, a identificação de substratos específicos de cada ubiquitina-ligase E3 é essencial para projetar um mapa abrangente de vários eventos biológicos. Embora a identificação de substratos verdadeiros seja bioquimicamente desafiadora, o uso de métodos baseados em bioquímica é muito adequado para avaliar a especificidade da cadeia e a distinção entre mono e poliumipremiado¹⁴. Este estudo descreve um protocolo completo para ensaio de onipresença usando a linha celular de mamíferos HEK293T sobreexpressando o substrato UXT-V2 (onipresentemente expresso como acompanhante de ubimia 2) com o complexo e3 ubiquitin-ligase SCF(Fbxo7). O UXT-V2 é um cofator essencial para a sinalização NF-κB, e uma vez que essa proteína é derrubada nas células, inibe a ativação NF-κB induzida por TN α F¹¹. Assim, para detectar o UXT-V2 poliutilítulo, o inibidor proteasome MG132 é utilizado, pois tem a capacidade de bloquear a atividade proteolítica da subunidade 26S do complexo^{proteasome 15}. Além disso, o extrato celular é submetido a um IP de pequena escala para purificar o substrato, utilizando um anticorpo específico imobilizado para resina agarose para posterior detecção por WB usando anticorpos selecionados. Este protocolo é muito útil para validar a ubiquização do substrato no ambiente celular, e também pode ser adaptado para diferentes tipos de células mamíferas e outros complexos de ubiquitina-ligase E3. No entanto, é necessário validar o substrato testado através de um ensaio de onipresença in vitro também, uma vez que ambos os protocolos se complementam em relação à identificação de substratos verdadeiros.