Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Posttranslationele modificaties (PTM’s) zijn een belangrijk mechanisme met betrekking tot eiwitregulatie, wat essentieel is voor celhomeostase. Eiwitubiquitylering is een dynamische en ingewikkelde modificatie die een assortiment van verschillende signalen creëert die resulteren in verschillende cellulaire uitkomsten in eukaryote organismen. Ubiquitylering is een omkeerbaar proces dat bestaat in de aanhechting van een ubiquitine-eiwit met 76 aminozuren aan het substraat, dat plaatsvindt in een enzymatische cascade bestaande uit drie verschillende reacties¹. De eerste stap wordt gekenmerkt door ubiquitine-activering, die afhankelijk is van een ATP-hydrolyse om een hoogenergetisch thioester-gebonden ubiquitine te vormen tussen de ubiquitine C-terminus en het cysteïneresidu dat aanwezig is op de actieve plaats van het E1-enzym. Vervolgens wordt het ubiquitine overgebracht naar het E2-enzym dat een thioester-achtig complex vormt met het ubiquitine. Daarna wordt het ubiquitine covalent aan het substraat gehecht door de E2, of vaker, door het E3-enzym, dat het substraat herkent en^ermee interageert ^2,3. Af en toe zijn E4-enzymen (Ubiquitine-keten rekfactoren) nodig om multiubiquitineketenassemblage te bevorderen³.

Ubiquitine heeft zeven lysineresiduen (K6, K11, K27, K29, K33, K48 en K63), waardoor de vorming van polyubiquitineketens mogelijk is die verschillende koppelingen genereren om verschillende driedimensionale structuren te produceren die door verschillende effectoreiwitten zullen worden herkend ^4,5. Daarom is het soort polyubiquitineketen dat in het substraat wordt geïntroduceerd essentieel om het lot van de cel te bepalen ^6,7,8. Bovendien kan het substraat ook worden alomtegenwoordig via zijn N-terminale residuen die N-degrons worden genoemd. Specifieke E3-ubiquitine-ligases zijn verantwoordelijk voor N-degron-herkenning, waardoor de polyubiquitylering van nabijgelegen lysineresidu^{9 mogelijk is}.

Tegenwoordig zijn er meer dan 40 verschillende SCF-specifieke substraten gekarakteriseerd. Onder die, belangrijke regulatoren van verschillende biologische routes, waaronder celdifferentiatie en ontwikkeling, evenals celoverleving en dood, kunnen worden gevonden 10,11,12,13. De identificatie van specifieke substraten van elke E3-ubiquitine-ligase is dus essentieel om een uitgebreide kaart van verschillende biologische gebeurtenissen te ontwerpen. Hoewel de identificatie van echte substraten biochemisch uitdagend is, is het gebruik van biochemische methoden zeer geschikt om ketenspecificiteit en het onderscheid tussen mono- en polyubiquitylering te evalueren¹⁴. Deze studie beschrijft een compleet protocol voor ubiquityleringstest met behulp van de zoogdiercellijn HEK293T die het substraat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) overexpressie met het E3 ubiquitine-ligase complex SCF (Fbxo7). UXT-V2 is een essentiële co-factor voor NF-κB-signalering, en zodra dit eiwit in cellen wordt neergehaald, remt het TNF-α-geïnduceerde NF-κB-activering¹¹. Om polyubiquitylated UXT-V2 te detecteren, wordt de proteasoomremmer MG132 gebruikt, omdat deze het vermogen heeft om de proteolytische activiteit van de 26S-subeenheid van het proteasoomcomplex¹⁵ te blokkeren. Bovendien wordt het celextract onderworpen aan een kleinschalig IP om het substraat te zuiveren, met behulp van een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd tot agarosehars voor latere detectie door WB met behulp van geselecteerde antilichamen. Dit protocol is zeer nuttig om substraatubiquitylering in de cellulaire omgeving te valideren, en het kan ook worden aangepast voor verschillende soorten zoogdiercellen en andere E3 ubiquitine-ligasecomplexen. Het is echter noodzakelijk om het geteste substraat ook te valideren door middel van een in vitro ubiquityleringstest, omdat beide protocollen elkaar aanvullen met betrekking tot de identificatie van echte substraten.