Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

La comunicazione tra l’epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell’intestino è fondamentale per il mantenimento dell’omeostasi intestinale¹. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali². Un esempio notevole di un regolatore critico dell’omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale³. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l’omeostasi intestinale e orchestrano l’infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine⁴.

Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine⁵. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall’espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)⁶ e secernono citochine associate all’immunità T helper di tipo 1 (T_{H H}1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all’interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-18⁷. Durante l’omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice⁸. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all’infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (T_H2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall’espressione del recettore orfano correlato all’acido retinoico (ROR) α (ROR-α)⁹ e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 “infiammatori” intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall’espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)¹³ dove rispondono a IL-25^14,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt¹⁶ e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-23¹⁷. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo¹⁸, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell’intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l’impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) ⁺ proliferazione delle cellule staminali intestinali¹⁹, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi^20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti²². Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD²³, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.

Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l’epitelio intestinale^24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5⁺ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici²⁶ o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l’inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin1²⁷ . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell’epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell’organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis²⁸. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento^29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.

Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell’infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema⁸.