細胞外小胞分析のための凍結破壊電子顕微鏡

1. がん性尿路上皮細胞の培養とEVの単離 注:ヒト浸潤性膀胱癌尿路上皮(T24)細胞株からEVを取得するためのプロトコルが提示されている。しかしながら、培養条件は、他の細胞型を使用するように最適化されなければならない。 3つのフラスコ(75cm2の増殖面)に3×104細胞/cm2の密度のT24細胞をプレートし、37°Cおよび5%CO2で3日間CO2インキュベーター内で細胞を培養することから始めます(図2A)。 5%ウシ胎児血清(FBS)、4 mM Glutamax、100 mg/mL ストレプトマイシン、および 100 U/mL ペニシリンを添加した A-DMEM と F12 の 1:1 (v/v) 混合物で T24 細胞用の培養液を使用します。注: 次の分離により、MV で強化された EV が得られます。単離を開始する前に、光学顕微鏡で細胞を検査し、生存率およびコンフルエントを確認する(図2B)。T24細胞が70%のコンフルエントに達したら、馴化培養培地からEVの回収を開始する。 フラスコ(T75)からピペットでMVsで培養培地を円錐形遠沈管に集めます(図2C)。遠心分離機を300× g で4°Cで10分間遠心分離する(図2D)。 上清をピペットで新しい遠沈管に慎重に集めます(図2E)。 上清を2,000 × gで4°Cで20分間遠心分離する。 ピペットで上清を新しい遠沈管に慎重に集めます。 10,000 × g で4°Cで40分間遠心分離する。 チューブの底に白っぽいペレットがあるかどうかを確認します。メモ:必要に応じて、遠心分離機のローターを必要なgフォースに達するように交換します。EVペレットは、遠沈管の底部に白いペレットとして見えます(図2F)。ピペッティング中にペレットを失わないように、その場所にマークを付けます(図2G)。 上清をピペットで慎重に捨てます。ペレットに 1.5 mL の PBS を加え、MV を含むペレットを再懸濁します。懸濁液を新しい遠沈管に入れます。 10,000 × g で40分間遠心分離し、チューブの底に白いペレットが存在するかどうかを確認します。注:EVペレットは、遠沈管の底部に白い斑点として表示されます。ピペッティング中にペレットを失うのを避けるために、その場所にマークを付けます。 上清をピペットで慎重に捨てます。固定液、2.5%グルタルアルデヒドを0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に穏やかに加える。4°Cで20分間放置する(図2H)。注意:グルタルアルデヒドとカコジル酸ナトリウムは有毒です。ヒュームフードで作業し、保護手袋を着用し、適切に廃棄してください。 固定液をピペットで慎重に取り除きます。洗浄バッファー(0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファー)をペレットに加えます。ペレットを再懸濁せずに4°Cで10分間放置する。 2. EVの凍結 注:凍結する前に、まずグリセロールでサンプルを凍結保護してください。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を調製する。洗浄バッファーを取り出し、0.1 M カコジル酸バッファーに 50 μL の 30% グリセロールを加えます。EVを静かに再懸濁して、溶液を均質にします。4°Cで30分間インキュベートする。 超音波浴中で中央ピットで銅キャリアをクロロホルムで5分間洗浄します(図3A)。複数のサンプルを使用する場合は、それらを空気乾燥させ、色でマークします(図3B)。使用するまでは、キャリアを乾燥した清潔な場所(例えば、ペトリ皿のレンズペーパーの上)に保管してください。素手でキャリアに触れないでください。 ピペット、溶液、ろ紙、ピンセット、実体顕微鏡、フロンと液体窒素(LN2)を入れたデュワーフラスコ、金属棒、およびクライオバイアルを準備します。LN2で冷却します。警告: LN2 および冷却されたフロンを取り扱うときは、保護具を着用し、それに応じて作業してください。 凍結する前にEVを再び吊り下げてください。気泡の形成を避けてください。メモ: 手順 2.4 ~ 2.7 を素早く実行します。 実体顕微鏡下で作業します(図3C)。1.5~1.7 μLのサンプルを銅キャリアの中央ピットに移し、サンプルをエッジ上にこぼさずに、銅キャリアエッジよりも高い位置まで凸状の液滴を作ります(図3D)。オーバースピルが発生した場合は、ろ紙を使用してキャリアの外輪を乾燥させます。 固化したフロンを金属棒で混ぜ合わせ、再び液化します(図3E)。 ピンセットで銅キャリアの外輪をつかみ、ピンセットを8秒間軽く振って冷却されたフロンに浸します(図3F)。8秒後、LN2で満たされた別のデュワーフラスコにキャリアを素早く移します。 サンプルの破砕または LN2 への保管を直ちに続行します。後者の場合、クライオビアルに印を付け、バイアルとピンセットの先端をLN2に沈めて冷却します(図3G)。LN 2 の下で、凍結した銅キャリアをバイアルに集めて閉じ、凍結破砕するまで LN2 コンテナ (図 3H) に保管します。 3. EVの破砕とレプリカ作り メモ: 凍結破砕ユニットは、製造元の取扱説明書に従って準備してください。(図4A)。ユニットのチャンバーを清掃します。プラチナ(Pt/C)ガンとカーボン(C)ガンをそれぞれ45°と90°の角度で配置します(図4B)。 ユニット真空システムを起動します。6.6 × 10-2 Pa(5 × 10-4 Torr)の圧力に達したら、ユニットチャンバを-150°Cまで冷却します。 凍結サンプルを含む銅キャリアを、乾式ピンセットを使用して凍結破砕ユニットに移します(図4C)。凍結転写を使用するか、サンプルの融解と氷結晶の堆積を避けるために速く作業してください。キャリアをサンプルテーブルに固定します。 真空が再び6.6 × 10-2 Pa(5 × 10-4 Torr)に達するまで待ってから、ナイフの温度を-100 °Cに設定します(図4D)。 真空が1.0 × 10-3 Pa(8 × 10-6 Torr)に達するまで待ちます。 双眼鏡でサンプルを観察し、ナイフに注意深く近づけます(図4E)。 ナイフの電動移動をオンにしてサンプルの切片化を開始し(図4F)、サンプルの表面が滑らかになるまで(図4G)切削します。 破砕のために、ナイフの電動運動をオフにし、ナイフのゆっくりとした手動制御で進行し、それによってサンプルを破砕する(図4H)。破断面が影になるまで氷の結晶や破片の形成から保護するために、破断したサンプルの上にナイフを動かします。 45°でPtシャドーイングを続行します(図4I、J)。 ストップウォッチを用意するか、凍結破砕ユニットの水晶モニターをオンにして、サンプルのPtの厚さを監視できるようにします。水晶振動子モニターで測定したPt層の推奨厚さは2.5nmで、これは所定の高張力および電流での4秒のシャドーイングに相当します(すなわち、Ptシャドーイングの速度は0.63nm/sです)。 シャドウイングを開始する前に、ナイフをサンプルから遠ざけます。Pt/Cガン(1,600V)にハイテンションをかけ、電流を60mAに増やします。Ptの火花が現れ、サンプルに影を落とし始めるはずです。この時点で、4秒のカウントダウンを開始するか、水晶振動子モニター上のPtの位置を観察して見つけます。メモ:C層の推奨厚さは2.5nmで、これは所定の高張力および電流での10秒のシャドーイングに相当します。 Ptの所望の厚さが得られたら、電流および高張力をオフにする。 C シャドーイングを 90° で続行します (つまり、C シャドウイングの速度は 0.25 nm/s です)。 Cガン(1,900V)にハイテンションをかけ、電流を90mAに上げると、Cの火花が現れてサンプルに影を落とし始めます。その時点で、10秒のカウントダウンを開始します。Cの所望の厚さが得られたら、電流および高張力をオフにする。 4. レプリカのクリーニングとレプリカ分析 サンプルテーブルの銅キャリアを使用し、ピンセットで磁器12ウェルプレート内の室温の蒸留水に移します(図4K)。レプリカは水面に浮かび、キャリアは沈みます(図4L)。 蒸留水からワイヤーループでレプリカを次亜塩素酸ナトリウムを含む井戸に移します。ふたをして、ヒュームフードに室温で一晩放置する。警告: 次亜塩素酸ナトリウムは有毒です。ヒュームフードで作業し、保護手袋を着用し、適切に廃棄してください。 レプリカをddH2Oに移し、30分間洗浄する。これを3回繰り返します。 ワイヤループでレプリカをメッシュ銅TEMグリッド(例えば、正方形またはハニカム100メッシュ以上)に転写する。グリッドを2時間空気乾燥させ、顕微鏡検査までグリッド収納ボックスに保管します。注:一般に、グリッドは暗く乾燥した室温条件下で数ヶ月間保管することができます。 TEM顕微鏡を使用してレプリカを画像化し、顕微鏡写真を取得します。 これを行うには、レプリカ付きのTEMグリッドを挿入し、製造元の取扱説明書に従ってTEMイメージングを開始します。80 kV または 100 kV で作業します。 サンプルを検査し、TEMのカメラで低倍率および高倍率で顕微鏡写真を取得します。 MVの顕微鏡写真を分析します。MV直径の測定には、フィジー/ImageJソフトウェア16を使用してください。MVの直径は、Hallett et al.17によると、顕微鏡写真での測定の4/π倍です。