מיקרוסקופיית אלקטרונים של שברים קפואים לניתוח שלפוחית חוץ-תאית

1. גידול תאי אורותל סרטניים ובידוד של כלי רכב חשמליים הערה: מוצג פרוטוקול לקבלת כלי רכב חשמליים מקו תאים פולשני של סרטן שלפוחית השתן האנושית (T24). עם זאת, יש לייעל את תנאי התרבות כדי להשתמש בסוגי תאים אחרים. תאי צלחת T24 עם צפיפות של 3 × 104 תאים/ס”מ2 בשלושה צלוחיות (משטח גידול של 75 ס”מ2) ומתחילים בגידול התאים באינקובטור CO2 למשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 (איור 2A). השתמשו במדיום תרבית עבור תאי T24 בתערובת של 1:1 (v/v) של A-DMEM ו-F12 בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), גלוטמקס של 4 mM, סטרפטומיצין של 100 מ”ג/מ”ל ו-100 פניצילין U/mL.הערה: הבידוד הבא מניב רכבים חשמליים מועשרים ברכבי MV. לפני תחילת הבידוד, בדקו את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות והמפגש (איור 2B). התחילו לאסוף את כלי הרכב החשמליים ממדיית התרבית המותנית כאשר תאי T24 נמצאים במפגש של 70%. אסוף את מדיום התרבות עם MVs עם פיפטה מצלוחיות (T75) לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים (איור 2C). צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (איור 2D). אספו בזהירות את חומר העל לתוך צינור צנטריפוגה חדש עם הפיפטה (איור 2E). צנטריפוגה הסופרנטנט ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. אספו בזהירות את הסופרנטנט עם הפיפטה לתוך צינור צנטריפוגה חדש. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חפשו נוכחות של כדור לבנבן בתחתית הצינור.הערה: במידת הצורך, שנה את רוטור הצנטריפוגה כדי להגיע לכוח ה- g הנדרש. כדור ה-EV נראה ככדור לבן בתחתית שפופרת הצנטריפוגה (איור 2F); סמן את מיקומו כדי למנוע אובדן של הכדור במהלך הצינורות (איור 2G). יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה. לכדור, הוסיפו 1.5 מ”ל של PBS והחזירו את הכדור המכיל MVs. הכניסו את המתלים לצינור צנטריפוגה חדש. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 40 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולחפש את נוכחותו של כדור לבן בתחתית הצינור.הערה: גלולת EV נראית ככתם לבן בתחתית צינור הצנטריפוגה; סמן את מיקומו כדי למנוע אובדן של הכדור במהלך הצינור. יש להשליך בזהירות את הסופרנטנט עם פיפטה. מוסיפים בעדינות את ה-fixative, 2.5% glutaraldehyde ב-0.1 M חיץ סודיום קקודילאט (pH 7.2). השאירו למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 2H).אזהרה: גלוטארלדהיד ונתרן קקודילאט רעילים. לעבוד במכסה אדים, ללבוש כפפות מגן ולהשליך אותן כראוי. בזהירות להסיר את הקיבוע עם פיפטה. הוסיפו לכדורית חיץ כביסה (0.1 מ’ חיץ נתרן קקודילאט). השאירו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מבלי לבצע שימוש חוזר בכדור. 2. הקפאת כלי רכב חשמליים הערה: לפני הקפאה, תחילה ההגנה על הדגימות עם גליצרול. מכינים 0.1 M חיץ נתרן קקודילאט. הסירו את מאגר הכביסה והוסיפו 50 μL של 30% גליצרול ב-0.1 M cacodylate buffer. בצעו שימוש חוזר עדין ברכבים החשמליים כדי להפוך את הפתרון להומוגני. אינקובציה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נקו את נושאי הנחושת עם בור מרכזי באמבטיה העל-קולית עם כלורופורם למשך 5 דקות (איור 3A). ייבשו אותם באוויר וסמנו אותם בצבעים אם אתם משתמשים בדגימות מרובות (איור 3B). עד לשימוש, יש לשמור את המנשאים במקום יבש ונקי (למשל, על נייר עדשה בצלחת פטרי). אין לגעת במנשאים בידיים חשופות. הכינו פיפטות, תמיסות, נייר סינון, פינצטה, סטריאומיקרוסקופ, בקבוקון דיואר עם פריון וחנקן נוזלי (LN2), מוט מתכת וקריוביצ’ים. קררו אותו עם LN2.אזהרה: ללבוש ציוד מגן ולעבוד בהתאם בעת טיפול LN2 ו freon מקורר. בצעו שוב שימוש חוזר ברכבים החשמליים לפני הקפאה. הימנעו מהיווצרות בועות אוויר.הערה: בצע שלבים 2.4-2.7 במהירות. עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 3C). העבר 1.5-1.7 μL של הדגימה לתוך הבור המרכזי של נושא הנחושת כדי ליצור טיפה קמורה המגיעה גבוה יותר מקצה נושא הנחושת תוך אי-שפיכת הדגימה על הקצה (איור 3D). במקרה של overspill, השתמש בנייר מסנן כדי לייבש את הטבעת החיצונית של המנשא. ערבבו פריון מוצק עם מוט מתכת כדי לנזול אותו שוב (איור 3E). אחזו בטבעת החיצונית של מנשא הנחושת בפינצטה והטבלו אותה לתוך פריון מקורר עם רעד עדין של פינצטה במשך 8 שניות (איור 3F). לאחר 8 שניות, העבירו במהירות את המוביל לבקבוקון אחר של דיואר מלא ב-LN2. המשך מיד עם שבירת או אחסון הדגימות ב- LN2. במקרה האחרון, סמנו קריוביאל וקררו את קצות הבקבוקון והפינצטה על ידי טבילתם לתוך LN2 (איור 3G). תחת LN2, אספו מנשאי נחושת קפואים לתוך הבקבוקון, סגרו אותו ואחסנו אותם במיכל LN2 (איור 3H) עד להקפאת ההקפאה. 3. שבירת כלי רכב חשמליים ויצירת העתקים הערה: הכן את יחידת ההקפאה-שבירת ההקפאה בהתאם להוראות ההפעלה של היצרן. (איור 4א). נקו את תא היחידה. מיקום תותחי פלטינה (Pt/C) ופחמן (C) בזוויות של 45° ו-90°, בהתאמה (איור 4B). הפעל את מערכת ואקום היחידה. כאשר מגיעים ללחץ של 6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), יש לקרר את תא היחידה ל-−-150°C. העבירו את נושאי הנחושת עם דגימות קפואות ליחידת שבירת הקפאה באמצעות פינצטה יבשה (איור 4C). השתמש cryotransfer או לעבוד מהר כדי למנוע הפשרה של הדגימה ואת התצהיר של גבישי הקרח. אבטח את הספקים על טבלת הדגימות. המתן עד שהוואקום יגיע שוב ל-6.6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr), ולאחר מכן הגדר את טמפרטורת הסכין ל-100−100°C (איור 4D). המתן עד שהוואקום יגיע ל-1.0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr). שימו לב לדגימה באמצעות משקפת והתקרבו בזהירות לסכין (איור 4E). התחילו לנתח את הדגימה על ידי הפעלת התנועה הממונעת של הסכין (איור 4F) ומקטעה עד שפני השטח של הדגימה יהיו חלקים (איור 4G). לצורך שבירת, כבו את התנועה הממונעת של הסכין והמשיכו בשליטה ידנית איטית על הסכין, ובכך שברו את הדגימה (איור 4H). על מנת להגן על המשטח השבור מפני יצירת גבישי קרח ופסולת עד להצללה, הזיזו את הסכין מעל הדגימה השבורה. המשך עם הצללת ה-Pt ב-45° (איור 4I, J). הכינו שעון עצר ו/או הפעילו את צג גביש הקוורץ ביחידת ההקפאה-שבירת ההקפאה, שתאפשר פיקוח על עובי ה-Pt על הדגימה. העובי המומלץ של שכבת ה-Pt כפי שנמדד בצג גביש הקוורץ הוא 2.5 ננומטר, אשר מתאים ל-4 שניות של הצללה במתח ובזרם גבוהים נתונים (כלומר, מהירות ההצללה של Pt היא 0.63 ננומטר לשנייה). לפני שתתחיל את ההצללה, הרחיקו את הסכין מהדגימה. הפעילו מתח גבוה על אקדח ה-Pt/C (1,600 וולט), והגדילו את הזרם ל-60 mA. ניצוצות של Pt צריכים להופיע וצריכים להתחיל לצלול על המדגם. בשלב זה, התחל את הספירה לאחור של 4 s ו/ או התבונן ואתר את המיקום של Pt על צג גביש הקוורץ.הערה: העובי המומלץ של שכבת C הוא 2.5 ננומטר, אשר מתאים ל-10 שניות של הצללה במתח ובזרם גבוהים מסוימים. כבה את הזרם ואת המתח הגבוה כאשר מתקבל העובי הרצוי של Pt. המשך עם הצללת C ב- 90° (כלומר, מהירות הצללת C היא 0.25 ננומטר לשנייה). החל מתח גבוה על אקדח C (1,900 V), הגדל את הזרם ל -90 mA, וניצוצות של C צריכים להופיע ולהתחיל לצלול על הדגימה; באותו רגע, התחל את הספירה לאחור של 10 שניות. כבה את הזרם ואת המתח הגבוה כאשר מתקבל העובי הרצוי של C. 4. ניקוי ההעתקים וניתוח העתקים השתמשו במנשאי הנחושת מטבלת הדגימות והעבירו אותם עם פינצטה למים מזוקקים בטמפרטורת החדר בצלחת חרסינה בת 12 בארות (איור 4K). ההעתקים יצופו על פני המים, בזמן שהנשאים ישקעו (איור 4L). מעבירים את ההעתקים עם לולאת חוט ממים מזוקקים לבאר עם נתרן היפוכלוריט. מכסים ועוזבים את הלילה בטמפרטורת החדר במכסה אדים.אזהרה: נתרן היפוכלוריט הוא רעיל. לעבוד במכסה אדים, ללבוש כפפות מגן ולהשליך אותן כראוי. מעבירים את ההעתקים ל-ddH2O ושוטפים למשך 30 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים. העבר את העותקים המשוכפלים באמצעות לולאת תיל לרשת TEM מנחושת רשת (למשל, רשת מרובעת או חלת דבש 100+). אוויר לייבש את הרשתות במשך 2 שעות, ולאחר מכן לאחסן אותם בתיבת אחסון רשת עד מיקרוסקופיה.הערה: באופן כללי, ניתן לאחסן רשתות במשך חודשים בתנאי טמפרטורת חדר חשוכים ויבשים. השתמש במיקרוסקופ TEM כדי לצלם את העותקים המשוכפלים ולקבל מיקרוגרפים. לשם כך, הכנס רשת TEM עם עותק משוכפל והתחל את הדמיית ה- TEM בהתאם למדריכי ההפעלה של היצרן. עבודה ב 80 kV או 100 kV. בדוק את הדגימה ורכוש מיקרוגרפים בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר עם מצלמה ב- TEM. לנתח את המיקרוגרפים של MVs. למדידות של קוטרי ה-MV, השתמשו בתוכנת Fiji/ImageJ16. קוטרם של MVs הוא פי 4/π מהמדידה במיקרוגרפים על פי Halett et al.17.