Dispositivos eletrônicos orgânicos flexíveis para terapia de campo elétrico pulsado de glioblastoma

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône e aprovada pelo comitê de ética da Provence Cote D’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Microfabricação flexível do dispositivo (Figura 1) Limpeza das lâminas de vidroLâminas de vidro Sonicate em solução de sabão a 2% por 15 min. Enxágue-os com água. Sonicate novamente em uma mistura de 80% de acetona pura e 20% de isopropanol puro por 15 min.CUIDADO: Estes solventes são nocivos e inflamáveis. Use equipamentos de proteção individual (EPI) e manuseie-os sob um exaustor. Lave as lâminas com isopropanol e seque com uma pistola de ar.NOTA: Certifique-se de que a acetona não seque nos substratos durante todo o processo. Padronização de eletrodos de ouro (Figura 1A)Depositar uma camada de 3 μm de parileno-C (PaC) com um sistema de deposição de parileno (Figura 1Aa).Coloque as lâminas de vidro limpas na câmara de deposição. Pulverize sabão no chiller, deixe secar e insira-o na armadilha fria designada do sistema de deposição. Este antiadesivo facilita a fácil remoção da PaC do chiller após a deposição.CUIDADO: A PaC é irritante e representa um perigo para a saúde. Use luvas ao manuseá-lo. Pesar 6 g de PaC em um barco de alumínio e colocá-lo no forno. Evacuar a máquina (P = 10 mTorr) e iniciar a deposição com os seguintes parâmetros: TChiller = -100 °C, TFurnace = 690 °C,T Vaporizer = 175 °C e TChamber = 135 °C. Quando a deposição estiver concluída e a temperatura do vaporizador estiver abaixo de 40 °C, desligue o resfriador, o vaporizador e o forno. Ventile a máquina e colete as amostras. Ativar a superfície das amostras por tratamento com plasma de oxigênio por 30 s (100 W, 50 sccm). Spin-coate as amostras tratadas com plasma com um fotorresistente negativo a 1.000 x g por 40 s. Colocar as amostras numa placa quente a 110 °C durante 2 min (figura 1Ab).CUIDADO: A solução fotorresistente é inflamável e causa irritação; use EPIs e manuseie-os sob um exaustor. Coloque um filtro i-line na linha de luz do alinhador de contato de banda larga UV e exponha o fotorresistente através de uma máscara que caracterize o design do eletrodo interdigitado (Figura 1Ac).NOTA: Eletrodos interdigitalizados com um espaço de 50 ou 250 μm foram projetados usando um editor de layout e fotomáscaras foram encomendadas de uma empresa que produz fotomáscaras de poliéster por fotoplotagem a laser. Asse as amostras acima a 110 °C numa placa quente durante 3 minutos e deixe-as arrefecer até à temperatura ambiente durante 5 minutos. Mergulhe as amostras em um revelador sem íons metálicos por 3 minutos para remover o fotorresistente não exposto. Enxaguar as amostras com água e secá-las com uma pistola de ar (Figura 1Ad).CUIDADO: A solução do desenvolvedor é irritante; usar EPI e manusear sob um exaustor. Ativar a superfície das amostras por tratamento com plasma de oxigênio por 60 s (100 W, 50 sccm). Depositar uma camada de adesão de 20 nm de cromo e uma camada de ouro de 300 nm com um evaporador térmico da seguinte forma (Figura 1Ae). Ventile a máquina evaporadora e prenda as amostras (viradas para baixo) na placa redonda superior com parafusos metálicos. Encha os cadinhos dedicados, respectivamente, com cromo e ouro. Sele e evacue a máquina para atingir uma pressão abaixo de 5·10-6 Torr. Inicie a rotação do suporte da amostra. Selecione o cadinho que contém cromo e aumente lentamente a corrente que passa por ele até que uma taxa de deposição de 0,2 Å·s-1 seja atingida. Abra o obturador e aguarde até que 20 nm de cromo sejam depositados. Feche o obturador e reduza lentamente a corrente até 0 mA. Selecione o cadinho que contém ouro e aumente lentamente a corrente que passa por ele até que uma taxa de deposição de 0,2 Å·s-1 seja atingida. Abra o obturador para evaporar o ouro, espere até que 10 nm de ouro seja depositado e, em seguida, aumente a taxa de deposição para 1,5 Å·s-1 até que aproximadamente 300 nm sejam depositados. Feche o obturador e reduza lentamente a corrente para 0 mA. Deixe as amostras arrefecerem até à temperatura ambiente durante 15 minutos após a deposição. Pare a rotação do suporte da amostra, ventile a máquina e colete as amostras. Mergulhe as amostras em um copo com acetona. Coloque o copo em uma placa de agitação ajustada a 110 rpm por 15 min para levantar o fotorresistente. Enxaguar as amostras com isopropanol e secá-las com pistola de ar (Figura 1Af). Ativar a superfície das amostras por tratamento com plasma de oxigênio por 30 s (100 W, 50 sccm). Depositar uma camada de isolamento de 3 μm de PaC com um sistema de deposição de parileno (ver passo 1.2.1) (Figura 1Ag). Abertura do contorno (Figura 1B)Girar as amostras com fotorresistência positiva a 600 x g por 35 s. Colocá-lo sobre uma placa quente a 110 °C durante 2 min (Figura 1Ba).CUIDADO: A solução fotorresistente é inflamável e causa irritação; usar EPI e manusear sob um exaustor. Certifique-se de que não há filtro i-line na linha de luz do alinhador de contato de banda larga UV e exponha o fotorresistente através de uma máscara que caracterize o contorno do dispositivo com um alinhador de contato de banda larga UV (Figura 1Bb). Mergulhe as amostras em um revelador livre de íons metálicos por 4 minutos para remover o fotorresistente exposto. Enxaguar as amostras com água e secá-las com uma pistola de ar (Figura 1Bc). Gravar o contorno através das duas camadas de PaC com um gravador de íons reativo (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figura 1Bd). Remova o fotorresistente restante com acetona, enxágue com isopropanol e seque as amostras com uma pistola de ar. PEDOT: Revestimento do PSS (Figura 1C)Spin-coat uma solução de sabão a 2% a 70 x g por 35 s (Figura 1Ca). Depositar uma camada sacrificial de PaC de 3 μm com um sistema de deposição de parileno (ver passo 1.2.1) (Figura 1Cb). Fotorresistência positiva de spin-coat a 600 x g por 35 s. Colocar as amostras numa placa quente a 110 °C durante 2 minutos (figura 1Cc). Certifique-se de que não há filtro i-line na linha de luz do alinhador de contato de banda larga UV e exponha o fotorresistente através de uma máscara que apresente a superfície ativa dos eletrodos (Figura 1Cd). Mergulhe as amostras em um revelador livre de íons metálicos por 4 minutos para remover o fotorresistente exposto. Enxaguar as amostras com água e secá-las com uma pistola de ar (Figura 1Ce). Gravar a PaC com uma colcha iónica reactiva para abrir a superfície activa dos eléctrodos (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Verifique com um microscópio se não há PaC residual na superfície ativa (Figura 1Cf). Remova o fotorresistente restante com acetona, enxágue com isopropanol e seque as amostras com uma pistola de ar. Ativar a superfície das amostras usando o tratamento com plasma de oxigênio por 90 s (100 W, 50 sccm). Misture uma dispersão comercial de PEDOT:PSS quimicamente polimerizado com 5 vol% de etilenoglicol (EG) e 0,1 vol% de ácido dodecilbenzeno sulfônico (DBSA). Sonicate por 15 min. Adicione 1 % em peso de (3-gliciloxipropil) trimetilsiloxano (GOPS) e sonicate por 5 min. Filtrar a solução através de um filtro de 1,2 μm.CUIDADO: EG é um irritante e representa um perigo para a saúde. DBSA é um irritante e corrosivo. O GOPS é corrosivo. Use EPIs apropriados e manuseie esses produtos químicos sob um exaustor.Observação : O volume total depende do número de amostras. Para 10 lâminas de vidro padrão, prepare pelo menos 20 mL que correspondam às seguintes quantidades: 18,78 mL de PEDOT:PSS, 1 mL de EG, 20 μL de DBSA e 200 μL de GOPS. Spin-coat quatro camadas de solução PEDOT:PSS a 150 x g por 35 s. Após a deposição de cada camada, cozer as amostras a 110 °C durante 60 s sobre uma placa quente e arrefecê-las até à temperatura ambiente durante 5 minutos antes de fiar a camada seguinte (Figura 1Cg). Retirar a camada de PaC sacrificial imergindo as amostras em água (Figura 1Ch). Assar as amostras a 140 °C durante 1 h. Imergir as amostras em água deionizada por 30 min para remover o sabão restante e os compostos de baixo peso molecular no filme PEDOT:PSS e para separar as amostras do substrato de vidro (Figura 1Ci). Conexões e empacotamento (Figura 1D)Deposite uma fina camada de tinta acrílica sobre um filme de poliimida revestido com cobre (Figura 1Da). Use um aerossol para obter uma camada homogênea de tinta (Figura 1Db). Padronizar a tinta acrílica com um laser (75 kHz, 7 W, 1 passagem a laser, 400 mm·s-1) para obter duas almofadas de contato retangulares (5 mm x 15 mm; 1,5 mm de folga) (Figura 1Dc). Enterre o cobre em água a 30% (p/v) de cloreto férrico saturado (FeCl3) em água durante 15 minutos a 40 °C (Figura 1Dd).CUIDADO: FeCl3 é um irritante e corrosivo; manuseie-o com luvas sob um exaustor. Retire a tinta acrílica com acetona, esfregando-a ligeiramente com um pano (Figura 1De). Corte o filme de poliimida padronizado em formas retangulares (15 mm x 30 mm) com um laser (15 kHz, 10 W, 30 passes de laser, 130 mm·s-1) (Figura 1Df). Dispensar pasta de prata com uma máquina distribuidora de três eixos a uma pressão de três bar com uma agulha de 330 μm de diâmetro (5 m·min-1) (Figura 1Dg).CUIDADO: A pasta de prata é um irritante; alça com luvas. Alinhar e fixar a sonda de PaC com o filme de poliimida sob um microscópio binocular usando pinças (Figura 1Dh).NOTA: As marcas de alinhamento podem ser padronizadas na etapa 1.5.2 para facilitar o posicionamento da sonda nas almofadas de contato. Asse a 140 °C durante 2 h no forno. Coloque uma fita de proteção de poliimida de 1 cm2 nas almofadas de contato (Figura 1Di). Mergulhe a interface onde a sonda PaC e o filme de poliimida estão conectados no PDMS (Figura 1Dj). Asse durante 2 h a 50 °C. Remova a fita de proteção para abrir as almofadas de contato (Figura 1Dk).NOTA: A microfabricação de dispositivos in vitro é semelhante, mas as etapas 1.2.1, 1.3 e 1.5 devem ser ignoradas. 2. Geração de glioblastoma GCaMP6f linhagem celular estável Produção de lentivírusEm um frasco de 75 cm², cultura de uma linhagem celular derivada de HEK 293T otimizada para a produção de lentivírus em 10 mL de Meio de Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco contendo 4,5 g· L-1 de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio e suplementado com 10% de soro fetal bovino livre de tetraciclina (FBS), 100 unidades·mL-1 de penicilina e 100 μg·mL-1 de estreptomicina por pelo menos 3 dias até 80% de confluência. Retirar o meio do balão. Lave suavemente as células com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 1 ml de solução de tripsina/EDTA a 0,25% e incubar o balão durante 5 minutos a 37 °C.CUIDADO: A solução de tripsina/EDTA representa um perigo para a saúde; usar EPI e manusear sob um exaustor. Adicionar 8 mL de meio de cultura. Lave suavemente a suspensão celular. Contar as células e a placa 4 x 106 células em uma placa de Petri em 8 mL de meio de cultura. No dia seguinte, diluir 25 μg do plasmídeo contendo o gene GCaMP6f e um marcador de seleção conferindo resistência à puromicina em um volume total de 600 μL de água. Adicione-o a um tubo de reagente de transfecção. Vórtice por 10 s a 3.000 rpm e incube o tubo à temperatura ambiente por 10 min para permitir a produção de nanopartículas. Adicione o conteúdo do tubo gota a gota na cultura de células T HEK 293 e agite suavemente à mão. Incubar células a 37 °C durante, pelo menos, 4 h. Substitua os meios que contêm complexos de nanopartículas por meios frescos e devolva as células a 37 °C. Três dias depois, coletar o sobrenadante e centrifugar a 500 x g por 10 min para remover os detritos celulares. Recolher a fase líquida contendo partículas virais.NOTA: A produção do vírus no sobrenadante pode ser confirmada usando um teste quantitativo de título de lentivirais e pode ser armazenada a -80 °C por pelo menos 2 anos. Transdução de células de glioblastomaNum balão de 75 cm², cultura de células de glioblastoma em 10 ml de DMEM contendo 1 g· L-1 de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio e suplementado com FBS 10% livre de tetraciclina, 100 unidades·mL-1 de penicilina e 100 μg·mL-1 de estreptomicina por pelo menos 4 dias. Rejeitar o meio e adicionar o sobrenadante obtido na etapa 2.1.9 nas células-alvo. Adicione 5 μg·mL-1 de brometo de hexadimetrina no meio para melhorar a transdução. Incubar durante 6 h a 37 °C. Substitua o meio por 10 mL de meio fresco.CUIDADO: O brometo de hexadimetrina é um irritante. Manusei-o com luvas. Geração de uma linhagem celular estávelDois a três dias após a transdução, adicionar 10 mL de DMEM contendo 1 g· L-1 de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, 10% FBS, 100 unidades·mL-1 de penicilina, 100 μg·mL-1 de estreptomicina e suplementado com puromicina para matar as células não transduzidas. Células de cultura neste meio por pelo menos 3 dias.CUIDADO: A puromicina é um irritante; manuseá-lo com luvas.NOTA: A sensibilidade das células à puromicina deve ser testada antes da transdução por células de cultura no seu meio recomendado contendo diferentes concentrações de puromicina. Um dia depois, verifique as células com um microscópio. Escolha a concentração adequada em que a maioria das células está morta, mas poucas ainda estão vivas, para garantir que o antibiótico não seja muito tóxico e possa matar as células transfectadas também. Retire o meio e enxágue as células com 10 mL de PBS. Adicionar 1 ml de 0,25% de uma solução de tripsina/EDTA e incubar o balão durante 5 minutos a 37 °C. Adicionar 8 mL de meio de cultura. Lave suavemente a suspensão celular. Recolher 100 μL de suspensão celular e medir a concentração celular com um contador de células. Aspirar 50 μL de suspensão celular em um contador de células automatizado portátil com um sensor de 60 μm. Semeie 1 célula/poço em uma placa de 96 poços. Por exemplo, para uma concentração de 1 x 10 3 células por mL, adicione 1 / (1 x 103), ou seja, 0,001 mL de suspensão celular por poço. Semeie cada poço para aumentar as chances de sucesso. Complete com meio de cultura para atingir um volume total de 200 μL por poço. Um dia depois, encontre cada poço contendo uma célula e verifique sua fluorescência (λexc = 490 nm e λem = 530 nm). Marque os poços que contêm apenas uma célula transfectada. Continue o crescimento por alguns dias até que o poço esteja quase confluente. Descarte o meio e enxágue as células com 200 μL de PBS. Adicionar 100 μL de solução de tripsina/EDTA a 0,25% e incubar a placa de 96 poços durante 5 min a 37 °C. Adicionar 100 μL de meio e lavar suavemente a suspensão celular. Transfira a suspensão celular em uma placa de Petri. Adicione 5 mL de meio e deixe as células crescerem por alguns dias até que a placa de Petri esteja quase confluente. Descarte o meio e enxágue as células com 5 mL de PBS. Adicionar 1 ml de solução de tripsina/EDTA a 0,25% e incubar a placa de Petri durante 5 min a 37 °C. Adicionar 6 ml de meio e lavar suavemente a suspensão celular. Transferir a suspensão celular para um balão T25. Continue o crescimento por alguns dias até que o balão esteja quase confluente. Descarte o meio e enxágue as células com 5 mL de PBS. Adicionar 1 ml de solução de tripsina/EDTA a 0,25% e incubar o balão T25 durante 5 min a 37 °C. Adicionar 7 ml de DMEM contendo 1 g· L-1 de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, e suplementado com 10% de FBS, 100 unidades·mL-1 de penicilina e 100 μg·mL-1 de estreptomicina. Lave suavemente a suspensão celular. Dividir a suspensão celular em quatro frascos de T25 (2 ml por balão) e adicionar 5 ml de meio a cada balão. Deixe as células crescerem por alguns dias até que os frascos estejam quase confluentes. Repetir o passo 2.3.12 para três balões e manter o último balão para o passo 3.1.3. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 150 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 900 μL. Misture suavemente as células para manter uma suspensão celular homogênea. Transfira a suspensão celular para frascos de armazenamento criogênico. Adicionar 100 μL de sulfóxido de dimetilo. Colocar os criovios a -80 °C durante a noite. Transfira células congeladas para nitrogênio líquido para novos experimentos.NOTA: A eficiência da transfecção pode ser avaliada pela adição de 5 μM de sal de cálcio de ionomicina no meio e verificando o aumento induzido da fluorescência sob um microscópio de fluorescência (λexc = 490 nm e λem = 530 nm). 3.3D modelos Cultura esferoidePreparar uma solução de agarose a 1% (p/v) em água deionizada (DI).Adicione 100 g de pó de agarose em 100 mL de água DI e aqueça a solução em um forno de micro-ondas até que todo o pó esteja dissolvido. Mexa a solução regularmente para evitar aglomerados. Autoclave a solução durante 20 min a 120 °C. Uma vez recuperado da autoclave, adicione 75 μL de solução de agarose por poço em uma placa de 96 poços com cuidado. Deposite-o no lado do poço para formar um menisco, resultando em um fundo redondo não aderente. Deixe solidificar por 15 min à temperatura ambiente. Retirar as células (etapa 2.3.12) do balão obtido na fase 2.3.14. Adicionar 10.000 células por poço de células de glioblastoma e completar para atingir um volume total de 150 μL por poço com DMEM contendo 1 g· L-1 de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades·mL-1 de penicilina e 100 μg·mL-1 de estreptomicina. Incubar as células a 37 °C sem mover a placa durante 3 dias. Em seguida, substitua metade da mídia por mídia nova a cada 2 dias por uma pipeta multicanal até novos experimentos. Mantenha a ponta da pipeta na parte superior do poço para evitar danos à agarose ou ao próprio esferoide.NOTA: O tamanho dos esferoides depende do número de células semeadas e da linhagem celular, por isso deve ser adaptado dependendo dos experimentos. O modelo in ovo Coloque ovos fertilizados de codorna japonesa (C. japonica) em uma incubadora (37 °C e 57% de umidade) em bandejas com um rotador automático que gira os ovos a cada 2 h. Este dia é considerado Dia Embrionário (ED) 0. Lave os barcos de pesagem de plástico, colocando-os em etanol a 70% (p/v). Retire os barcos de pesagem e seque-os sob um exaustor.NOTA: A partir deste ponto, os experimentos não são realizados em condições estéreis. No entanto, condições limpas são necessárias para evitar o desenvolvimento de mofo nos embriões. No ED3, abra suavemente os ovos usando uma pinça com pontas finas pré-lavadas com etanol a 70% (p/v). Deite o embrião num barco de pesagem de plástico, cubra-o com outro barco de pesagem e coloque-o numa incubadora humidificada padrão a 37 °C durante 3 dias. No ED6, faça uma pequena incisão na membrana corioalantóica (CAM) com uma agulha de 23 G. Usando uma pipeta, coloque um esferoide de 7 dias na incisão e devolva o embrião à incubadora por 3 dias, até novos experimentos.NOTA: Um corante fluorescente pode ser injetado no olho do embrião para visualizar os vasos sanguíneos. No dia do experimento, coloque a sonda flexível em cima do tumor vascularizado usando um micromanipulador. O in vivo modeloNOTA: Esta parte do protocolo é adaptada da anteriormente publicada em referência14. Foram utilizados camundongos adultos fluorescentes multicoloridos AMU-Neuroinflam (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); esses camundongos apresentam marcação de uma subpopulação de Thy1+ neurônios por expressão transgênica de ECFP, marcação de LyzM periférico+ células inflamatórias por expressão transgênica de EGFP e marcação de um subtipo de micróglia expressando EYFP sob o controle de Cd11c+. Em resumo, os animais são levemente sedados com isoflurano a 1,5% por 2 minutos antes de qualquer tratamento ou injeção. Antes da cirurgia, os animais são anestesiados com cetamina (120 mg/kg; IP) e Xilazina (12 mg/kg; IP). Em seguida, o gel de lidocaína a 3% é aplicado localmente para aliviar qualquer dor nos ouvidos associada à fixação do suporte estereotáxico. Em seguida, a solução de bupivacaína a 0,25% é administrada no local cirúrgico para aliviar qualquer dor devido à craniotomia. Uma vez preparado o camundongo para a cirurgia, uma craniotomia de 4 mm de diâmetro foi realizada de acordo com a referência14. Com uma agulha de 26 G, foi feito um orifício na dura-máter no meio da craniotomia e o esferoide tumoral foi injetado com o sistema de injeção descrito na referência14. Além disso, como descrito aqui, um eletrodo flexível foi colocado no GCamp6 ou DsRed expressando esferoide tumoral antes de selar a craniotomia com uma janela de vidro.Coloque uma gota de Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) para que cubra a craniotomia. Coloque o eletrodo flexível na gota de DPBS e coloque suavemente a parte de trás da sonda com almofadas de contato na parte de trás do mouse (Figura 4B).NOTA: Use luvas estéreis e uma técnica de “apenas ponta”. Troque as luvas se uma superfície não estéril for contatada. Forneça suporte térmico durante este procedimento. Toque na gota de DPBS com um pequeno pedaço de papel para absorver o DPBS até que a sonda possa ficar plana na dura-máter e seguir a curvatura do cérebro. Certifique-se de que uma pequena camada de DPBS permaneça abaixo dos eletrodos sem escapar do lado do eletrodo. Isso garante uma barreira contra o transbordamento de cola durante as próximas etapas.NOTA: Esterilize todos os equipamentos antes de usar. Coloque uma pequena gota de adesivo de silicone na sonda e cubra-a com um vidro de cobertura redonda de 5 mm. Empurre o vidro da tampa para baixo até que o silicone esteja uniformemente distribuído e a distância entre o vidro da tampa e a sonda seja mínima. Empurre o vidro da tampa para baixo por mais 30 s para que o silicone possa se solidificar. Para fixar o vidro da tampa, aplique rapidamente a supercola em seus lados e empurre-a para baixo até que a cola se torne sólida. Usando um palito de dente, aplique supercola no pescoço da sonda, tomando cuidado para que a supercola seja desenhada sob o pescoço para fornecer suporte estável para ela. Cubra o crânio com cimento dental para construir uma tampa crônica. Tome especial cuidado para cobrir apenas as bordas do vidro da tampa. Levante a parte de trás da sonda e aplique cimento sob o pescoço da sonda. Coloque a sonda no cimento antes que ele cure. Empurre o pescoço da sonda suavemente com pinça contundente para que sua superfície esteja no mesmo nível que a do vidro da tampa e não no caminho da objetiva do microscópio durante o experimento. Cubra a parte superior do pescoço da sonda com não mais de 1,5 mm de camada de cimento dentário para obter uma fixação firme na sonda. Construir um poço de cimento apresentando uma crista de 1,5 mm a uma distância de 1-2 mm ao redor do vidro de cobertura para criar uma bacia para o fluido de imersão para a imagem de dois fótons (Figura 4C). Após a cura do cimento, aplicar analgésicos pós-cirúrgicos de buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,1 mL por 10 g de peso corporal por via subcutânea) e manter o animal em ambiente quente até que ele acorde. Isso inclui a proximidade de uma lâmpada infravermelha, bem como embrulhar o animal em uma toalha de papel.NOTA: Coloque um termômetro no nível do mouse para monitorar a temperatura. Caracterizar a impedância na faixa de 1-10 kHz usando um potenciostato. Deixe o animal se recuperar da cirurgia por pelo menos 10 dias. Administrar anti-inflamatórios imediatamente após a cirurgia e continuar monitorando o estado do animal para fornecer analgesia pós-operatória apropriada. 4. Entrega e imagem do Campo Elétrico Pulsado (PEF) Coloque os espécimes sob um microscópio de fluorescência. No caso dos modelos 3D, os tumores só podem ser observados a partir do topo.NOTA: Para o modelo in ovo , os experimentos foram realizados em microscópio de epifluorescência (mas também é possível com microscópio de dois fótons), enquanto os experimentos no modelo in vivo foram realizados sob microscópio de dois fótons (Figura 6). Conecte um gerador de pulso às almofadas de contato dos dispositivos, usando conectores de pino pogo (in vitro) ou clipes de crocodilo (in ovo e in vivo) (Figura 4A). Defina os parâmetros desejados (número de pulsos, tensão, duração do pulso, frequência) e aplique os PEFs executando o gerador (Figura 4A). Meça a fluorescência simultaneamente para observar os efeitos dos PEFs em tempo real.