Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la legislazione francese e in conformità con la Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) per la cura e l’uso di animali da laboratorio. La ricerca sugli animali è stata autorizzata dalla Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône e approvata dal comitato etico della Provence Cote D’Azur (Apafis # 22689-2019100414103054). 1. Microfabbricazione flessibile del dispositivo (Figura 1) Pulizia dei vetriniSonicare vetrini in soluzione di sapone al 2% per 15 minuti. Risciacquarli con acqua. Sonicare nuovamente in una miscela di 80% di acetone puro e 20% di isopropanolo puro per 15 minuti.ATTENZIONE: Questi solventi sono nocivi e infiammabili. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e maneggiarli sotto una cappa aspirante. Risciacquare i vetrini con isopropanolo e asciugare con una pistola ad aria compressa.NOTA: Assicurarsi che l’acetone non si asciughi sui substrati durante l’intero processo. Pattern di elettrodi d’oro (Figura 1A)Depositare uno strato di 3 μm di parylene-C (PaC) con un sistema di deposizione di parylene (Figura 1Aa).Posizionare i vetrini puliti nella camera di deposizione. Spruzzare il sapone sul refrigeratore, lasciarlo asciugare e inserirlo nella trappola fredda designata del sistema di deposizione. Questo antiadesivo facilita la rimozione del PaC dal refrigeratore dopo la deposizione.ATTENZIONE: PaC è irritante e rappresenta un pericolo per la salute. Indossare guanti durante la manipolazione. Pesare 6 g di PaC in una barca di alluminio e metterlo nel forno. Evacuare la macchina (P = 10 mTorr) e avviare la deposizione con i seguenti parametri: TChiller = -100 °C, TFurnace = 690 °C, TVaporizer = 175 °C eT Chamber = 135 °C. Quando la deposizione è terminata e la temperatura del vaporizzatore è inferiore a 40 °C, spegnere il refrigeratore, il vaporizzatore e il forno. Sfiatare la macchina e raccogliere i campioni. Attivare la superficie dei campioni mediante trattamento al plasma con ossigeno per 30 s (100 W, 50 sccm). Spin-coat i campioni trattati al plasma con un fotoresist negativo a 1.000 x g per 40 s. Porre i campioni su una piastra calda a 110 °C per 2 minuti (figura 1Ab).ATTENZIONE: La soluzione fotoresistente è infiammabile e provoca irritazione; indossare DPI e maneggiarli sotto una cappa aspirante. Posizionare un filtro i-line nella beamline dell’allineatore a contatto a banda larga UV ed esporre il fotoresist attraverso una maschera che presenta il design dell’elettrodo interdigitato (Figura 1Ac).NOTA: Gli elettrodi interdigitati con uno spazio di 50 o 250 μm sono stati progettati utilizzando un editor di layout e le fotomaschere sono state ordinate da un’azienda che produce fotomaschere in poliestere mediante fotoplotting laser. Cuocere i campioni di cui sopra a 110 °C su una piastra calda per 3 minuti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 5 minuti. Immergere i campioni in uno sviluppatore privo di ioni metallici per 3 minuti per rimuovere il fotoresist non esposto. Risciacquare i campioni con acqua e asciugarli con una pistola ad aria compressa (Figura 1Ad).ATTENZIONE: la soluzione per sviluppatori è irritante; indossare DPI e maneggiare sotto una cappa aspirante. Attivare la superficie dei campioni mediante trattamento al plasma con ossigeno per 60 s (100 W, 50 sccm). Depositare uno strato di adesione di 20 nm di cromo e uno strato di oro di 300 nm con un evaporatore termico come segue (Figura 1Ae). Sfiatare l’evaporatore e agganciare i campioni (rivolti verso il basso) sulla piastra rotonda superiore con viti metalliche. Riempi i crogioli dedicati, rispettivamente, con cromo e oro. Sigillare ed evacuare la macchina per raggiungere una pressione inferiore a 5·10-6 Torr. Avviare la rotazione del portacampioni. Selezionare il crogiolo contenente cromo e aumentare lentamente la corrente che lo attraversa fino a raggiungere una velocità di deposizione di 0,2 Å·s-1 . Aprire l’otturatore e attendere che si depositino 20 nm di cromo. Chiudere l’otturatore e scendere lentamente la corrente fino a 0 mA. Selezionare il crogiolo contenente oro e aumentare lentamente la corrente che lo attraversa fino a raggiungere un tasso di deposizione di 0,2 Å·s-1 . Aprire l’otturatore per far evaporare l’oro, attendere fino a quando non si depositano 10 nm d’oro, quindi aumentare la velocità di deposizione a 1,5 Å·s-1 fino a depositare circa 300 nm. Chiudere l’otturatore e ridurre lentamente la corrente fino a 0 mA. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti dopo la deposizione. Interrompere la rotazione del portacampioni, sfiatare la macchina e raccogliere i campioni. Immergere i campioni in un becher con acetone. Posizionare il becher su una piastra di agitazione impostata a 110 giri / min per 15 minuti per sollevare il fotoresist. Risciacquare i campioni con isopropanolo e asciugarli con una pistola ad aria compressa (Figura 1Af). Attivare la superficie dei campioni mediante trattamento al plasma con ossigeno per 30 s (100 W, 50 sccm). Depositare uno strato isolante di 3 μm di PaC con un sistema di deposizione di parylene (vedere punto 1.2.1) (Figura 1Ag). Apertura del contorno (Figura 1B)Spin-coat i campioni con un fotoresist positivo a 600 x g per 35 s. Posizionare su una piastra calda a 110 °C per 2 minuti (Figura 1Ba).ATTENZIONE: La soluzione fotoresistente è infiammabile e provoca irritazione; indossare DPI e maneggiare sotto una cappa aspirante. Assicurarsi che non vi sia alcun filtro i-line nella beamline dell’allineatore di contatti a banda larga UV ed esporre il fotoresist attraverso una maschera che presenta il contorno del dispositivo con un allineatore a contatto a banda larga UV (Figura 1Bb). Immergere i campioni in uno sviluppatore privo di ioni metallici per 4 minuti per rimuovere il fotoresist esposto. Risciacquare i campioni con acqua e asciugarli con una pistola ad aria compressa (Figura 1Bc). Incidere il contorno attraverso i due strati di PaC con un incisore ionico reattivo (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figura 1Bd). Rimuovere il fotoresist rimanente con acetone, risciacquare con isopropanolo e asciugare i campioni con una pistola ad aria compressa. PEDOT:Rivestimento PSS (Figura 1C)Spin-coat una soluzione di sapone al 2% a 70 x g per 35 s (Figura 1Ca). Depositare uno strato sacrificale di 3 μm di PaC con un sistema di deposizione di parylene (vedi passo 1.2.1) (Figura 1Cb). Fotoresist positivo spin-coat a 600 x g per 35 s. Porre i campioni su una piastra calda a 110 °C per 2 minuti (Figura 1Cc). Assicurarsi che non vi sia alcun filtro i-line nella beamline dell’allineatore a contatto a banda larga UV ed esporre il fotoresist attraverso una maschera che presenta la superficie attiva degli elettrodi (Figura 1Cd). Immergere i campioni in uno sviluppatore privo di ioni metallici per 4 minuti per rimuovere il fotoresist esposto. Risciacquare i campioni con acqua e asciugarli con una pistola ad aria compressa (Figura 1Ce). Incidere il PaC con un incisore ionico reattivo per aprire la superficie attiva degli elettrodi (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Verificare con un microscopio che non vi sia alcun PaC residuo sulla superficie attiva (Figura 1Cf). Rimuovere il fotoresist rimanente con acetone, risciacquare con isopropanolo e asciugare i campioni con una pistola ad aria compressa. Attivare la superficie dei campioni utilizzando il trattamento al plasma con ossigeno per 90 s (100 W, 50 sccm). Miscelare una dispersione commerciale di PEDOT:PSS polimerizzato chimicamente con 5 vol% di glicole etilenico (EG) e 0,1 vol% di acido dodecilbenzensolfonico (DBSA). Sonicate per 15 min. Aggiungere 1 wt% di (3-glicidilossipropil) trimetilsilossano (GOPS) e sonicare per 5 min. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 1,2 μm.ATTENZIONE: EG è irritante e rappresenta un pericolo per la salute. DBSA è irritante e corrosivo. GOPS è corrosivo. Indossare DPI appropriati e maneggiare queste sostanze chimiche sotto una cappa aspirante.NOTA: il volume totale dipende dal numero di campioni. Per 10 vetrini standard, preparare almeno 20 ml corrispondenti alle seguenti quantità: 18,78 ml di PEDOT:PSS, 1 mL di EG, 20 μL di DBSA e 200 μL di GOPS. Spin-coat quattro strati di soluzione PEDOT:PSS a 150 x g per 35 s. Dopo la deposizione di ogni strato, cuocere i campioni a 110 °C per 60 s su una piastra calda e raffreddarli a temperatura ambiente per 5 minuti prima di centrifugare lo strato successivo (Figura 1Cg). Rimuovere lo strato di PaC sacrificale immergendo i campioni in acqua (Figura 1Ch). Cuocere i campioni a 140 °C per 1 ora. Immergere i campioni in acqua deionizzata per 30 minuti per rimuovere il sapone rimanente e i composti a basso peso molecolare nel film PEDOT:PSS e per staccare i campioni dal substrato di vetro (Figura 1Ci). Connessioni e imballaggio (Figura 1D)Depositare un sottile strato di vernice acrilica su un film di poliimmide rivestito di rame (Figura 1Da). Utilizzare un aerosol per ottenere uno strato omogeneo di vernice (Figura 1Db). Modellare la vernice acrilica con un laser (75 kHz, 7 W, 1 passaggio laser, 400 mm·s-1) per ottenere due cuscinetti di contatto rettangolari (5 mm x 15 mm; 1,5 mm di spazio) (Figura 1Dc). Incidere a umido il rame con cloruro ferrico saturo al 30% (p/v) (FeCl3) in acqua per 15 minuti a 40 °C (Figura 1Dd).ATTENZIONE: FeCl3 è irritante e corrosivo; Maneggiarlo con i guanti sotto una cappa aspirante. Rimuovere la vernice acrilica con acetone strofinandola leggermente con un panno (Figura 1De). Tagliare la pellicola di poliimmide modellata in forme rettangolari (15 mm x 30 mm) con un laser (15 kHz, 10 W, 30 passaggi laser, 130 mm·s-1) (Figura 1Df). Erogare la pasta d’argento con una macchina erogatrice a tre assi ad una pressione di tre bar con un ago di 330 μm di diametro (5 m·min-1) (Figura 1Dg).ATTENZIONE: La pasta d’argento è irritante; maneggiare con i guanti. Allineare e collegare la sonda PaC con la pellicola di poliimmide al microscopio binoculare usando una pinzetta (Figura 1Dh).NOTA: i segni di allineamento possono essere modellati nel punto 1.5.2 per facilitare il posizionamento della sonda sui pad di contatto. Cuocere in forno a 140 °C per 2 ore. Posizionare un nastro protettivo in poliimmide da 1 cm2 sui cuscinetti di contatto (Figura 1Di). Immergere l’interfaccia in cui la sonda PaC e la pellicola di poliimmide sono collegate in PDMS (Figura 1Dj). Cuocere in forno per 2 h a 50 °C. Rimuovere il nastro di protezione per aprire i cuscinetti di contatto (Figura 1Dk).NOTA: la microfabbricazione di dispositivi in vitro è simile, ma i passaggi 1.2.1, 1.3 e 1.5 devono essere saltati. 2. Generazione della linea cellulare stabile GCaMP6f di Glioblastoma Produzione di lentivirusIn un matraccio da 75 cm², coltivare una linea cellulare derivata da HEK 293T ottimizzata per la produzione di lentivirus in 10 ml di Modified Eagle’s Medium (DMEM) di Dulbecco contenente 4,5 g· L-1 di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio e integrato con il 10% di siero bovino fetale privo di tetracicline (FBS), 100 unità·mL-1 di penicillina e 100 μg·mL-1 di streptomicina per almeno 3 giorni fino alla confluenza dell’80%. Rimuovere il mezzo dal pallone. Risciacquare delicatamente le cellule con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C.ATTENZIONE: La soluzione di tripsina/EDTA rappresenta un pericolo per la salute; indossare DPI e maneggiare sotto una cappa aspirante. Aggiungere 8 ml di terreno di coltura. Lavare delicatamente la sospensione cellulare. Contare le cellule e placcare 4 x 106 cellule in una capsula di Petri in 8 ml di terreno di coltura. Il giorno successivo, diluire 25 μg del plasmide contenente il gene GCaMP6f e un marcatore di selezione che conferisce resistenza alla puromicina in un volume totale di 600 μL di acqua. Aggiungerlo a un tubo di reagente di trasfezione. Vortice per 10 s a 3.000 giri / min e incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la produzione di nanoparticelle. Aggiungere il contenuto del tubo a goccia sulla coltura di cellule T HEK 293 e dondolare delicatamente a mano. Incubare le cellule a 37 °C per almeno 4 ore. Sostituire i mezzi contenenti complessi di nanoparticelle con nuovi mezzi e riportare le celle a 37 °C. Tre giorni dopo, raccogliere il surnatante e centrifugare a 500 x g per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere la fase liquida contenente particelle virali.NOTA: La produzione del virus nel surnatante può essere confermata utilizzando un test quantitativo del titolo lentivirale e può essere conservata a -80 °C per almeno 2 anni. Trasduzione delle cellule di glioblastomaIn un matraccio di 75 cm², colture di cellule di glioblastoma in 10 mL di DMEM contenenti 1 g· L-1 di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio e integrato con FBS privo di tetracicline al 10%, 100 unità·mL-1 di penicillina e 100 μg·mL-1 di streptomicina per almeno 4 giorni. Scartare il terreno e aggiungere il surnatante ottenuto al punto 2.1.9 sulle cellule bersaglio. Aggiungere 5 μg·mL-1 di esadimetrina bromuro nel mezzo per migliorare la trasduzione. Incubare per 6 h a 37 °C. Sostituire il terreno con 10 ml di terreno fresco.ATTENZIONE: Il bromuro di esadimetrina è irritante. Maneggialo con i guanti. Generazione di una linea cellulare stabileDue o tre giorni dopo la trasduzione, aggiungere 10 mL di DMEM contenente 1 g· L-1 di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, 10% FBS, 100 unità·mL-1 di penicillina, 100 μg·mL-1 di streptomicina e integrato con puromicina per uccidere le cellule non trasdotte. Cellule di coltura in questo mezzo per almeno 3 giorni.ATTENZIONE: La puromicina è irritante; Maneggiarlo con i guanti.NOTA: La sensibilità delle cellule alla puromicina deve essere testata prima della trasduzione coltivando cellule nel loro mezzo raccomandato contenente diverse concentrazioni di puromicina. Il giorno dopo, controlla le cellule con un microscopio. Scegli la concentrazione adeguata alla quale la maggior parte delle cellule sono morte ma poche sono ancora vive, per garantire che l’antibiotico non sia troppo tossico e possa uccidere anche le cellule trasfettate. Rimuovere il mezzo e risciacquare le cellule con 10 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione allo 0,25% di tripsina/EDTA e incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 8 ml di terreno di coltura. Lavare delicatamente la sospensione cellulare. Raccogliere 100 μL di sospensione cellulare e misurare la concentrazione cellulare con un contatore cellulare. Aspirare 50 μL di sospensione cellulare in un contatore di celle automatizzato portatile con un sensore da 60 μm. Seminare 1 cellula/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Ad esempio, per una concentrazione di 1 x 10 3 cellule per ml, aggiungere 1 / (1 x 103), cioè 0,001 ml di sospensione cellulare per pozzetto. Semina ogni pozzo per aumentare le possibilità di successo. Completare con terreno di coltura per raggiungere un volume totale di 200 μL per pozzetto. Il giorno dopo, trovare ogni pozzetto contenente una cellula e controllarne la fluorescenza (λexc = 490 nm e λem = 530 nm). Segna i pozzetti contenenti una sola cella trasfettata. Continuare la crescita per alcuni giorni fino a quando il pozzo è quasi confluente. Scartare il mezzo e sciacquare le cellule con 200 μL di PBS. Aggiungere 100 μL di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 100 μL di terreno e lavare delicatamente la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in una capsula di Petri. Aggiungere 5 ml di terreno e lasciare crescere le cellule per alcuni giorni fino a quando la capsula di Petri è quasi confluente. Scartare il mezzo e sciacquare le cellule con 5 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare la capsula di Petri per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 6 mL di terreno e lavare delicatamente la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio T25. Continuare la crescita per alcuni giorni fino a quando il pallone è quasi confluente. Scartare il mezzo e sciacquare le cellule con 5 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare il matraccio T25 per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 7 mL di DMEM contenente 1 g· L-1 di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, e integrato con il 10% di FBS, 100 unità·mL-1 di penicillina e 100 μg·mL-1 di streptomicina. Lavare delicatamente la sospensione cellulare. Dividere la sospensione cellulare in quattro matraccio T25 (2 mL per pallone) e aggiungere 5 mL di terreno a ciascun pallone. Lasciare crescere le cellule per alcuni giorni fino a quando i palloni sono quasi confluenti. Ripetere il punto 2.3.12 per tre matramenti e conservare l’ultimo matraccio per il punto 3.1.3. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 900 μL. Mescolare delicatamente le cellule per mantenere una sospensione cellulare omogenea. Trasferire la sospensione cellulare in flaconcini di conservazione criogenica. Aggiungere 100 μL di dimetilsolfossido. Porre i crioviali a -80 °C durante la notte. Trasferire le cellule congelate in azoto liquido per ulteriori esperimenti.NOTA: L’efficienza della trasfezione può essere valutata aggiungendo 5 μM di sale di calcio ionomicina nel mezzo e controllando l’aumento indotto della fluorescenza al microscopio a fluorescenza (λexc = 490 nm e λem = 530 nm). 3.3D modelli Cultura sferoidalePreparare una soluzione di agarosio all’1% (p/v) in acqua deionizzata (DI).Aggiungere 100 g di polvere di agarosio in 100 ml di acqua DI e riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando tutta la polvere è sciolta. Mescolare regolarmente la soluzione per evitare grumi. Autoclavare la soluzione per 20 min a 120 °C. Una volta estratto dall’autoclave, aggiungere con attenzione 75 μL di soluzione di agarosio per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Depositalo sul lato del pozzo per formare un menisco, risultando in un fondo rotondo non aderente. Lasciare solidificare per 15 minuti a temperatura ambiente. Staccare le celle (punto 2.3.12) dal matraccio ottenuto al punto 2.3.14. Aggiungere 10.000 cellule per pozzetto di cellule di glioblastoma e completare fino a raggiungere un volume totale di 150 μL per pozzetto con DMEM contenente 1 g· L-1 di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, e integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 unità·mL-1 di penicillina e 100 μg·mL-1 di streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C senza muovere la piastra per 3 giorni. Quindi, sostituire metà del supporto con nuovi supporti ogni 2 giorni con una pipetta multicanale fino a ulteriori esperimenti. Tenere la punta della pipetta nella parte superiore del pozzetto per evitare danni all’agarosio o allo sferoide stesso.NOTA: La dimensione degli sferoidi dipende dal numero di cellule seminate e dalla linea cellulare, quindi deve essere adattata a seconda degli esperimenti. Il modello in ovo Mettere le uova fecondate di quaglia giapponese (C. japonica) in un’incubatrice (37 °C e 57% di umidità) su vassoi con un rotatore automatico che gira le uova ogni 2 ore. Questo giorno è considerato Embryonic Day (ED) 0. Lavare i pesatori di plastica mettendoli in etanolo al 70% (p/v). Estrarre i battelli di pesatura e asciugarli sotto una cappa aspirante.NOTA: Da questo punto, gli esperimenti non vengono eseguiti in condizioni sterili. Tuttavia, sono necessarie condizioni pulite per evitare lo sviluppo di muffe sugli embrioni. Su ED3, aprire delicatamente le uova usando una pinzetta con punte sottili pre-lavate con etanolo al 70% (w / v). Versare l’embrione in un contenitore di pesatura di plastica, coprirlo con un altro battello di pesatura e metterlo in un’incubatrice umidificata standard a 37 °C per 3 giorni. Su ED6, praticare una piccola incisione nella membrana corioallantoica (CAM) con un ago da 23 G. Usando una pipetta, posizionare uno sferoide di 7 giorni sull’incisione e riportare l’embrione nell’incubatore per 3 giorni, fino a ulteriori esperimenti.NOTA: Un colorante fluorescente può essere iniettato nell’occhio dell’embrione per visualizzare i vasi sanguigni. Il giorno dell’esperimento, posizionare la sonda flessibile sopra il tumore vascolarizzato utilizzando un micromanipolatore. Le in vivo modelloNOTA: Questa parte del protocollo è adattata da quella precedentemente pubblicata in riferimento14. Sono stati utilizzati topi adulti fluorescenti multicolore AMU-Neuroinflam (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); questi topi presentano l’etichettatura di una sottopopolazione di Thy1+ neuroni mediante espressione transgenica di ECFP, marcatura di LyzM periferico+ cellule infiammatorie mediante espressione transgenica di EGFP e marcatura di un sottotipo di microglia che esprime EYFP sotto il controllo di Cd11c+. In breve, gli animali sono leggermente sedati con isoflurano all’1,5% per 2 minuti prima di qualsiasi trattamento o iniezione. Prima dell’intervento, gli animali vengono anestetizzati con ketamina (120 mg/kg; IP) e xilazina (12 mg/kg; IP). Quindi, il gel di lidocaina al 3% viene applicato localmente per alleviare qualsiasi dolore alle orecchie associato alla fissazione del supporto stereotassico. Quindi, la soluzione di bupivacaina allo 0,25% viene somministrata al sito chirurgico per alleviare qualsiasi dolore dovuto alla craniotomia. Una volta che il topo è stato preparato per l’intervento chirurgico, è stata eseguita una craniotomia di 4 mm di diametro secondo il riferimento14. Con un ago da 26 G, è stato praticato un foro nella dura-mater nel mezzo della craniotomia e lo sferoide tumorale è stato iniettato con il sistema di iniezione descritto in riferimento14. Inoltre, come descritto qui, un elettrodo flessibile è stato posizionato sul GCamp6 o DsRed che esprime lo sferoide tumorale prima di sigillare la craniotomia con una finestra di vetro.Posizionare una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) in modo che copra la craniotomia. Posizionare l’elettrodo flessibile sulla goccia di DPBS e posizionare delicatamente la parte posteriore della sonda con i cuscinetti di contatto sul dorso del mouse (Figura 4B).NOTA: Utilizzare guanti sterili e una tecnica “solo punta”. Cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile. Fornire supporto termico durante questa procedura. Toccare la goccia DPBS con un piccolo pezzo di carta per assorbire DPBS fino a quando la sonda può giacere piatta sulla dura e seguire la curvatura del cervello. Assicurarsi che un piccolo strato di DPBS rimanga sotto gli elettrodi senza fuoriuscire dal lato dell’elettrodo. Ciò garantisce una barriera contro lo spillover della colla durante le fasi successive.NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell’uso. Posizionare una piccola goccia di adesivo siliconico sulla sonda e coprirla con un vetro di copertura rotondo da 5 mm. Spingere il vetro di copertura verso il basso fino a quando il silicone è distribuito uniformemente e la distanza tra il vetro di copertura e la sonda è minima. Spingere il vetro di copertura verso il basso per altri 30 secondi in modo che il silicone possa solidificarsi. Per fissare il vetro di copertura, applicare rapidamente la supercolla sui lati e spingerla verso il basso fino a quando la colla non si polimerizza fino a diventare solida. Usando uno stuzzicadenti, applicare la supercolla al collo della sonda facendo attenzione che la supercolla venga disegnata sotto il collo per fornire un supporto stabile per esso. Coprire il cranio con cemento dentale per costruire un cappuccio cronico. Prestare particolare attenzione a coprire solo i bordi del vetro di copertura. Sollevare la parte posteriore della sonda e applicare il cemento sotto il collo della sonda. Appoggiare la sonda sul cemento prima che si polimerizzi. Spingere delicatamente verso il basso il collo della sonda con una pinza smussata in modo che la sua superficie sia allo stesso livello di quella del vetro di copertura e non intralciante l’obiettivo del microscopio durante l’esperimento. Coprire la parte superiore del collo della sonda con non più di 1,5 mm di strato di cemento dentale per ottenere una presa salda sulla sonda. Costruire un pozzo di cemento che presenti una cresta di 1,5 mm ad una distanza di 1-2 mm attorno al vetro di copertura per creare un bacino per il fluido di immersione per l’imaging a due fotoni (Figura 4C). Dopo che il cemento si è indurito, applicare analgesici post-chirurgici di buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,1 ml per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea) e mantenere l’animale in un’atmosfera calda fino al suo risveglio. Ciò include la vicinanza a una lampadina a infrarossi e l’avvolgimento dell’animale in un tovagliolo di carta.NOTA: posizionare un termometro a livello del mouse per monitorare la temperatura. Caratterizzare l’impedenza nell’intervallo 1-10 kHz utilizzando un potenziostato. Lascia che l’animale si riprenda dall’intervento chirurgico per almeno 10 giorni. Somministrare farmaci antinfiammatori immediatamente dopo l’intervento chirurgico e continuare a monitorare lo stato dell’animale per fornire un’adeguata analgesia post-operatoria. 4. Erogazione e imaging del campo elettrico pulsato (PEF) Posizionare i campioni sotto un microscopio a fluorescenza. Nel caso di modelli 3D, i tumori possono essere osservati solo dall’alto.NOTA: Per il modello in ovo , gli esperimenti sono stati eseguiti al microscopio a epifluorescenza (ma è possibile anche con un microscopio a due fotoni), mentre gli esperimenti sul modello in vivo sono stati eseguiti al microscopio a due fotoni (Figura 6). Collegare un generatore di impulsi ai pad di contatto dei dispositivi, utilizzando connettori pogo pin (in vitro) o clip a coccodrillo (in ovo e in vivo) (Figura 4A). Impostare i parametri desiderati (numero di impulsi, tensione, durata dell’impulso, frequenza) e applicare i PEF facendo funzionare il generatore (Figura 4A). Misurare la fluorescenza simultaneamente per osservare gli effetti dei PEF in tempo reale.