用于胶质母细胞瘤脉冲电场治疗的柔性有机电子器件

所有实验程序均按照法国立法和1986年11月24日欧洲共同体理事会关于实验动物护理和使用的指令（86/609 / EEC）进行。对动物的研究得到了罗纳河畔布希斯服务部的授权，并得到了普罗旺斯蔚蓝海岸伦理委员会（Apafis # 22689-2019100414103054）的批准。 1. 柔性器件微细加工（图1） 清洁载玻片在2%肥皂溶液中超声处理载玻片15分钟。用水冲洗。 在80%纯丙酮和20%纯异丙醇的混合物中再次超声处理15分钟。注意：这些溶剂有害且易燃。穿戴个人防护装备 （PPE） 并在通风橱下处理。 用异丙醇冲洗载玻片并用气枪擦干。注意：确保在整个过程中丙酮不会在基材上干燥。 金电极图案化（图 1A)用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm的Parylene-C（PaC）层（图1Aa）。将清洁的载玻片放入沉积室中。将肥皂喷洒在冷却器上，使其干燥，然后将其插入沉积系统的指定冷阱中。这种防粘性有助于在沉积后轻松从冷却器中去除 PaC。注意：PaC是一种刺激物，对健康构成危害。处理时戴手套。 在铝制舟中称取6克PaC并将其放入炉中。抽空机器（P = 10 mTorr）并使用以下参数开始沉积：T冷却 器= -100°C，T炉 = 690°C，T蒸发器 = 175°C，T室 = 135°C。 当沉积完成并且汽化器的温度低于40°C时，关闭冷却器，汽化器和炉子。放空机器并收集样品。 通过氧等离子体处理激活样品表面30秒（100W，50sccm）。 用负光刻胶以1，000 x g 旋转涂覆等离子体处理过的样品40秒。将样品置于110°C的热板上2分钟（图1Ab）。注意：光刻胶溶液易燃，会引起刺激;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 将i线滤光片放在紫外宽带接触对准器的光束线中，并通过具有指叉电极设计的掩模曝光光刻胶（图1Ac）。注意：间隙为 50 或 250 μm 的叉指电极是使用布局编辑器设计的，光掩模是从一家通过激光光印生产聚酯光掩模的公司订购的。 将上述样品在110°C的热板上烘烤3分钟，然后冷却至室温5分钟。将样品浸入无金属离子显影剂中3分钟以去除未曝光的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Ad）。注意：显影剂解决方案是一种刺激物;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 通过氧等离子体处理激活样品表面60秒（100W，50sccm）。 用热蒸发器沉积20nm铬粘附层和300nm金层，如下所示（图1Ae）。 排气蒸发器机器，用金属螺钉将样品（面朝下）夹在上圆板上。分别用铬和金填充专用坩埚。密封并抽空机器，以达到低于5·10-6 托的压力。开始样品架的旋转。 选择含有铬的坩埚，慢慢增加通过它的电流，直到达到0.2 Å·s-1 的沉积速率。打开快门，等待 20 nm 的铬沉积。关闭快门并缓慢降低电流，直到 0 mA。 选择含有金的坩埚，慢慢增加通过它的电流，直到达到0.2 Å·s-1 的沉积速率。打开快门蒸发金，等到沉积10nm的金，然后将沉积速率增加到1.5 Å·s-1 ，直到沉积约300 nm。关闭快门，缓慢将电流逐渐降低至 0 mA。 沉积后让样品冷却至室温15分钟。停止样品架的旋转，排气机器，收集样品。 将样品浸入装有丙酮的烧杯中。将烧杯放在设置为110rpm的振动板上15分钟以抬起光刻胶。用异丙醇冲洗样品并用气枪干燥（图1Af）。 通过氧等离子体处理激活样品表面30秒（100W，50sccm）。 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm的PaC绝缘层（见步骤1.2.1）（图1Ag）。 轮廓开口（图1B）用阳性光刻胶以600 x g 旋转涂覆样品35秒。将其置于110°C的热板上2分钟（图1Ba）。注意：光刻胶溶液易燃，会引起刺激;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 确保紫外宽带接触对准器的光束线中没有i线滤光片，并通过具有紫外宽带接触对准器的设备轮廓的掩模曝光光刻胶（图1Bb）。 将样品浸入无金属离子显影剂中4分钟以去除暴露的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Bc）。 用反应离子蚀刻机（160 W，22分钟，O2：50 sccm，CF4：10 sccm）通过两层PaC蚀刻轮廓（图1Bd）。 用丙酮去除剩余的光刻胶，用异丙醇冲洗，然后用气枪干燥样品。 PEDOT：PSS涂层（图1C）将2%肥皂溶液以70 x g 旋转涂覆35秒（图1Ca）。 用聚对二甲苯沉积系统沉积3μm牺牲层PaC（参见步骤1.2.1）（图1Cb）。 旋涂正光刻胶在600 x g 下旋转35秒。将样品置于110°C的热板上2分钟（图1Cc）。 确保紫外宽带接触对准器的光束线中没有i线滤光片，并通过具有电极活性表面的掩模曝光光刻胶（图1Cd）。 将样品浸入无金属离子显影剂中4分钟以去除暴露的光刻胶。用水冲洗样品并用气枪干燥（图1Ce）。 用反应离子蚀刻机蚀刻PaC以打开电极的活性表面（160 W，24分钟，O2：50 sccm，CF4：10 sccm）。用显微镜检查活性表面上没有残留的PaC（图1Cf）。 用丙酮去除剩余的光刻胶，用异丙醇冲洗并用气枪干燥样品。 使用氧等离子体处理激活样品表面90秒（100W，50sccm）。 将化学聚合的PEDOT：PSS的商业分散体与5体积%的乙二醇（EG）和0.1体积%的十二烷基苯磺酸（DBSA）混合。超声处理15分钟。加入1wt%（3-甘草酰氧基丙基）三甲基硅氧烷（GOPS）并超声处理5分钟。通过1.2μm过滤器过滤溶液。注意：EG是一种刺激物，对健康构成危害。DBSA是一种刺激性和腐蚀性物质。GOPS具有腐蚀性。穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱下处理这些化学品。注意：总体积取决于样品数量。对于 10 张标准载玻片，准备至少 20 mL 对应于以下数量：18.78 mL PEDOT：PSS、1 mL EG、20 μL DBSA 和 200 μL GOPS。 将四层PEDOT：PSS溶液在150 x g 下旋转涂覆35秒。每层沉积后，将样品在110°C下在热板上烘烤60秒，并将它们冷却至室温5分钟，然后旋转下一层（图1Cg）。 通过将样品浸入水中来去除牺牲的PaC层（图1Ch）。 将样品在140°C烘烤1小时。 将样品浸入去离子水中30分钟，以除去PEDOT：PSS薄膜中剩余的肥皂和低分子量化合物，并将样品从玻璃基板上分离（图1Ci）。 连接和封装（图 1D）在涂有铜的聚酰亚胺薄膜上沉积一层薄薄的丙烯酸涂料（图1Da）。使用气溶胶获得均匀的油漆层（图1Db）。 用激光（75 kHz，7 W，1 次激光通过，400 mm·s-1）对丙烯酸涂料进行图案化，以获得两个矩形接触垫（5 mm x 15 mm;1.5 mm间隙）（图1Dc）。 在40°C下用饱和的30%（w / v）氯化铁（FeCl3）在水中湿蚀铜15分钟（图1Dd）。注意：氯化铁3 具有刺激性和腐蚀性;在通风橱下戴手套处理它。 用布轻轻擦拭丙烯漆，用丙酮剥离丙烯酸涂料（图1De）。 用激光（15 kHz，10 W，30 次激光通过，130 mm·s-1）将图案化的聚酰亚胺薄膜切割成矩形（15 mm x 30 mm）（图1Df）。 用三轴点胶机在三巴的压力下用直径为330μm的针头（5m·min-1）分配银浆（图1Dg）。注意：银浆是一种刺激物;戴手套处理。 使用镊子在双目显微镜下将PaC探针与聚酰亚胺薄膜对齐并连接（图1Dh）。注意： 可以在步骤 1.5.2 中对准标记进行图案化，以便于将探头定位在接触垫上。 在烤箱中在140°C烘烤2小时。 将 1 cm2 聚酰亚胺保护胶带放在接触垫上（图 1Di）。 浸入PDMS中连接PaC探针和聚酰亚胺薄膜的接口（图1Dj）。 在50°C下烘烤2小时。 取下保护胶带以打开接触垫（图1Dk）。注意： 体外 设备的微细加工类似，但必须跳过步骤1.2.1，1.3和1.5。 2. 胶质母细胞瘤GCaMP6f稳定细胞系的产生 慢病毒生产在 75 cm² 烧瓶中，在含有 4.5 g· 的 10 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中培养针对慢病毒生产优化的 HEK 293T 衍生细胞系葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的L-1，并补充10%无四环素胎牛血清（FBS）、100单位·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素至少3 d，直至80%汇合。 从烧瓶中取出培养基。用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗细胞。 加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将烧瓶在37°C孵育5分钟。注意：胰蛋白酶/EDTA溶液对健康构成危害;穿戴个人防护装备并在通风橱下处理。 加入 8 mL 培养基。轻轻冲洗细胞悬液。 计数细胞并在 8 mL 培养基中的培养皿中培养 4 x 106 个细胞。 第二天，在总体积为600μL的水中稀释25μg含有基因GCaMP6f和赋予嘌呤霉素抗性的选择标记的质粒。将其添加到转染试剂管中。以3，000rpm涡旋10秒，并在室温下孵育管10分钟以产生纳米颗粒。 将试管的内容物滴加到HEK 293 T细胞的培养物上，并用手轻轻摇动。将细胞在37°C孵育至少4小时。 用新鲜培养基替换含有纳米颗粒复合物的培养基，并在37°C下返回细胞。 三天后，收集上清液并以500× g 离心10分钟以除去细胞碎片。收集含有病毒颗粒的液相。注意：可以使用定量慢病毒滴度测试确认上清液中的病毒产生，并且可以在-80°C下储存至少2年。 胶质母细胞瘤细胞转导在75 cm²烧瓶中，将胶质母细胞瘤细胞培养在含有1 g·葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠的L-1，并补充10%无四环素FBS、100单位·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素至少4天。 弃去培养基，在目标细胞上加入步骤2.1.9中获得的上清液。 在培养基中加入5 μg·mL-1 的六二甲基溴化物以提高转导效果。在37°C孵育6小时。 用 10 mL 新鲜培养基替换培养基。注意：六二甲基溴化物是一种刺激物。戴手套处理。 生成稳定的细胞系转导后2-3天，加入10 mL含1 g·葡萄糖L-1、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠、10S、100单位·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素，并补充嘌呤霉素杀死非转导细胞。在该培养基中培养细胞至少3天。注意：嘌呤霉素是一种刺激物;戴手套处理。注意：细胞对嘌呤霉素的敏感性必须在转导前通过在含有不同浓度嘌呤霉素的推荐培养基中培养细胞来测试。一天后，用显微镜检查细胞。选择大多数细胞死亡但少数细胞还活着的适当浓度，以确保抗生素不会毒性太大，并且也可能杀死转染的细胞。 取出培养基并用 10 mL PBS 冲洗细胞。 加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将烧瓶在37°C孵育5分钟。 加入 8 mL 培养基。轻轻冲洗细胞悬液。 收集 100 μL 细胞悬液并使用细胞计数器测量细胞浓度。在带有 60 μm 传感器的手持式自动细胞计数仪中吸出 50 μL 细胞悬液。 在 96 孔板中接种 1 个细胞/孔。例如，对于浓度为1 x 10 3个细胞/mL，加入1 / （1 x 103），即每孔0.001mL细胞悬液。播种每一口井以增加成功的机会。用培养基完成，达到每孔 200 μL 的总体积。 一天后，找到每个含有一个细胞的孔并检查其荧光（λexc = 490 nm和λem = 530 nm）。标记仅包含一个转染细胞的孔。继续生长几天，直到井几乎汇合。 弃去培养基并用 200 μL PBS 冲洗细胞。加入 100 μL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，并将 96 孔板在 37 °C 下孵育 5 分钟。 加入 100 μL 培养基并轻轻冲洗细胞悬液。将细胞悬液转移到培养皿中。加入5mL培养基，让细胞生长几天，直到培养皿几乎汇合。 弃去培养基并用 5 mL PBS 冲洗细胞。加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将培养皿在37°C孵育5分钟。 加入 6 mL 培养基并轻轻冲洗细胞悬液。将细胞悬液转移到T25烧瓶中。继续生长几天，直到烧瓶几乎汇合。 弃去培养基并用 5 mL PBS 冲洗细胞。加入1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA溶液，并将T25烧瓶在37°C孵育5分钟。 加入7 mL含1 g·葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠L-1，并补充10S、青霉素100单位·mL-1、链霉素100μg·mL-1。轻轻冲洗细胞悬液。 将细胞悬液分成四个T25烧瓶（每个烧瓶2mL），并向每个烧瓶中加入5mL培养基。让细胞生长几天，直到烧瓶几乎汇合。 对三个烧瓶重复步骤2.3.12，并在步骤3.1.3中保留最后一个烧瓶。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并以 150 x g 离心 5 分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于900μL中。 轻轻混合细胞以保持均匀的细胞悬液。 将细胞悬液转移到低温储存瓶中。加入 100 μL 二甲基亚砜。将冷冻管在-80°C下过夜。将冷冻细胞转移到液氮中进行进一步实验。注意：通过在培养基中加入5μM离聚霉素钙盐并在荧光显微镜下检查荧光的诱导增加（λexc = 490 nm和λem = 530 nm）可以评估转染的效率。 3.3D 型号 球状体培养在去离子（DI）水中制备1%（w / v）琼脂糖溶液。在100mL去离子水中加入100g琼脂糖粉末，并在微波炉中加热溶液，直到所有粉末溶解。定期搅拌溶液以避免结块。将溶液在120°C高压灭菌20分钟。 从高压釜中取出后，在 96 孔板中小心地每孔加入 75 μL 琼脂糖溶液。将其沉积在孔的侧面以形成弯月面，从而形成不粘附的圆底。让它在室温下凝固15分钟。 将细胞（步骤2.3.12）从步骤2.3.14中获得的烧瓶中分离。 每孔胶质母细胞瘤细胞加入 10，000 个细胞并完成，使用含有 1 g· 的 DMEM 达到每孔 150 μL 的总体积葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠L-1，并补充10%胎牛血清（FBS）、青霉素100单位·mL-1和链霉素100μg·mL-1。 在不移动板的情况下在37°C孵育细胞3天。然后，每2天用多通道移液管用新鲜培养基替换一半的培养基，直到进一步实验。将移液器尖端保持在孔的上部，以避免损坏琼脂糖或球体本身。注意：球体的大小取决于接种的细胞数量和细胞系，因此必须根据实验进行调整。 卵中模型将日本鹌鹑（C. japonica）的受精卵放入孵化器（37°C和57%湿度）的托盘上，自动旋转器每2小时翻转一次鸡蛋。这一天被认为是胚胎日（ED）0。 将塑料称重船放入 70% （w/v） 乙醇中清洗塑料称重船。取出称重船，在通风橱下干燥。注意：从这一点开始，实验不在无菌条件下进行。然而，需要清洁的条件以避免胚胎上发霉。 在 ED3 上，使用镊子轻轻打开鸡蛋，镊子的细尖端用 70% （w/v） 乙醇预先清洗。将胚胎倒入塑料称量舟中，用另一称量船盖住，并将其置于37°C的标准加湿培养箱中3天。 在 ED6 上，用 23 G 针在脉络膜尿囊膜 （CAM） 上做一个小切口。 使用移液管，将7天的球体放在切口上，然后将胚胎放回培养箱3天，直到进一步实验。注意：可以将荧光染料注射到胚胎的眼睛中以可视化血管。 在实验当天，使用显微操纵器将柔性探针放在血管化肿瘤的顶部。 这 in vivo 型注意：协议的这一部分改编自之前在参考文献中发布的协议14.使用成年多色荧光AMU-神经蛋白脂小鼠（B6.Cg-Tg（Thy1-CFP）23Jrs（Ly6a-EGFP）G5Dzk（Itgax-EYFP）1Mnz / FD）;这些小鼠呈现Thy1亚群的标记+ 通过ECFP的转基因表达神经元，外周LyzM的标记+ 通过转基因表达EGFP和标记在Cd11c控制下表达EYFP的小胶质细胞亚型来刺激细胞+.简而言之，在任何治疗或注射之前，用1.5%异氟醚轻轻镇静动物2分钟。手术前，用氯胺酮（120mg / kg;IP）和甲苯噻嗪（12毫克/千克;知识产权）。然后，局部施用3%利多卡因凝胶以减轻与立体定向支持固定相关的耳朵疼痛。然后，将0.25%布比卡因溶液施用于手术部位以减轻开颅术引起的任何疼痛。一旦小鼠准备好手术，根据参考进行直径为4mm的开颅手术14.用26G针在开颅术中间的硬脑膜上开一个孔，并用参考文献中描述的注射系统注射肿瘤球状体14.此外，如此处所述，在用玻璃窗密封开颅术之前，将柔性电极放置在表达肿瘤球体的GCamp6或DsRed上。放置一滴Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），使其覆盖开颅术。将柔性电极放在DPBS的液滴上，然后用接触垫轻轻地将探头的背面放在鼠标的背面（图4B）。注意：使用无菌手套和“仅尖端”技术。如果接触非无菌表面，请更换手套。在此过程中提供热支持。 用一小张纸触摸DPBS液滴以吸收DPBS，直到探针可以平放在硬脑膜上并跟随大脑的曲率。确保一小层DPBS保留在电极下方，而不会从电极侧面逸出。这确保了在接下来的步骤中防止胶水溢出。注意：使用前对所有设备进行消毒。 将一小滴硅胶粘合剂滴在探头上，并用 5 mm 圆形盖玻片覆盖。向下推盖玻片，直到硅胶均匀分布，盖玻片与探头之间的距离最小。将盖玻片再向下推 30 秒，使硅胶凝固。 要固定盖玻片，请快速在其侧面涂上强力胶并将其向下推，直到胶水固化为固体。 使用牙签在探头的颈部涂抹强力胶，注意将强力胶拉到颈部下方，为其提供稳定的支撑。 用牙科水泥覆盖颅骨以建立慢性帽。请特别注意仅遮盖盖板玻璃的边缘。 抬起探头的背面，在探头颈部下方涂上水泥。在固化之前将探针放在水泥上。在实验过程中，用钝钳轻轻向下推探头的颈部，使其表面与盖玻片的表面处于同一水平，并且不会妨碍显微镜物镜。 用不超过1.5毫米的牙科水泥层覆盖探头颈的顶部，以牢固地固定探头。在盖玻片周围 1-2 毫米的距离处建造一个水泥井，呈现一个 1.5 毫米的脊，为用于双光子成像的浸没液创建一个盆地（图 4C）。 水泥固化后，应用丁丙诺啡术后镇痛药（0.05 mg / kg，皮下注射每10g体重0.1mL），并将动物保持在温暖的气氛中，直到它醒来。这包括靠近红外灯泡以及用纸巾包裹动物。注意：将温度计放在鼠标水平以监控温度。 使用恒电位仪表征 1-10 kHz 范围内的阻抗。 让动物从手术中恢复至少 10 天。手术后立即服用消炎药，并继续监测动物的状态，以提供适当的术后镇痛。 4. 脉冲电场 （PEF） 传输和成像 将标本置于荧光显微镜下。在3D模型的情况下，肿瘤只能从顶部观察。注意：对于 卵内 模型，实验在落射荧光显微镜下进行（但也可以使用双光子显微镜），而 体内 模型的实验在双光子显微镜下进行（图6）。 使用弹簧针连接器（体外）或鳄鱼夹（卵 和 体内）（图4A）将脉冲发生器连接到设备的接触垫。设置所需的参数（脉冲数、电压、脉冲持续时间、频率）并通过运行发生器应用 PEF（图 4A）。同时测量荧光以实时观察PEF的影响。