탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리
Summary
여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
뇌에 상주하는 선천적 면역 세포 인 Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 염증 또는 손상에 대한 주요 반응자입니다. 미세아교세포는 휴지 상태와 활성화 상태로 나눌 수 있으며 뇌의 미세 환경에 반응하여 상태를 빠르게 변화시킬 수 있습니다. Microglia는 다른 병리학 적 조건 하에서 활성화되고 다른 표현형을 나타낼 것입니다. 또한, 활성화된 미세아교세포의 많은 상이한 하위군이 존재하며, 상이한 하위군 사이에 큰 이질성이 있다. 이질성은 주로 미세아교세포의 분자 특이성에 의존한다. 연구에 따르면 microglia가 활성화되고 염증성 탈수초화의 병리학 적 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 나타났습니다. 다발성 경화증 및 신경 척수염 옵티카 스펙트럼 장애와 같은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 특성을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 perilesional 원발성 미세아교세포 분류 프로토콜을 제안한다. 이 프로토콜은 원주형 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 고도로 정제 된 일차 미세 아교세포를 얻고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하여 염증성 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 잠재적 영향을 조사합니다.
Introduction
Microglia는 노른자 – 낭 선조에서 유래하며, 배아 뇌에 매우 일찍 도달하여 CNS 1,2의 발달에 참여합니다. 예를 들어, 그들은 시냅스 가지치기3 및 축삭 성장 조절4에 관여한다. 그들은 신경 생존을 촉진하고 신경 국소화를 돕는 인자를 분비합니다5. 동시에, 그들은 정상적인 뇌 발달을 보장하기 위해 비정상적인 세포와 사멸 세포를 제거하는 데 관여합니다6. 또한, 뇌의 면역능력이 있는 세포로서, 미세아교세포는 뇌 실질종을 지속적으로 감시하여 죽은 세포, 기능장애성 시냅스, 세포 파편7을 제거한다. 미세아교세포 활성화가 염증성 탈수초성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 뇌종양을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. 다발성 경화증 (MS)에서 활성화된 미세아교세포는 올리고덴드로사이트 전구체 세포 (OPCs)의 분화 및 미엘린 파편을 삼킴으로써 미엘린의 재생에 기여한다8.
알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 축적은 미세 아교세포를 활성화시켜 미세 아교세포9의 식세포 및 염증 기능에 영향을 미칩니다. 신경교종 관련 미세아교세포(GAM)라고 불리는 신경교종 조직에서 활성화된 미세아교세포는 신경교종의 진행을 조절할 수 있으며 궁극적으로 환자(10)의 예후에 영향을 미칠 수 있다. 활성화는 미세아교세포 전사체를 심오하게 변화시켜 형태학적 변화, 면역 수용체의 발현, 식세포 활성 증가, 사이토카인 분비 강화(11)를 초래한다. 신경 퇴행성 질환에서 활성화된 미세아교세포의 상이한 서브세트, 예컨대 질환 관련 미세아교세포 (DAM), 활성화된 반응 미세아교세포 (ARM), 및 미세아교세포 신경퇴행성 표현형(MGnD)8이 있다.
유사하게, 미세아교세포의 다수의 동적 기능적 서브세트는 또한 염증성 탈수초성 질환(12)에서 뇌에 공존한다. 미세아교세포의 상이한 서브세트 사이의 이질성을 이해하는 것은 염증성 탈수초성 질환의 발병기전을 조사하고 그들의 잠재적인 치료 전략을 찾는 데 필수적이다. 미세아교세포의 이질성은 주로 분자 특이성8에 의존한다. 이질성의 연구를 위해 미세 아교세포의 분자 변화를 정확하게 설명하는 것이 필수적입니다. 단일 세포 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 기술의 발전은 병리학 적 조건13에서 활성화 된 미세 아교세포의 분자 특성의 확인을 가능하게했습니다. 따라서, 세포 집단을 단리하는 능력은 특정 조건 하에서 이들 표적 세포의 추가 조사를 위해 중요하다.
microglia의 특성과 기능을 이해하기 위해 수행 된 연구는 일반적으로 시험관 내 연구이며, 많은 수의 1 차 미세 아교세포가 배양 플라스크에 부착되고 다른 혼합 신경교 세포와 함께 플라스틱 표면에서 자라는 마우스 강아지 두뇌 (1-3 일 이전)에서 제조되고 배양 될 수 있음이 밝혀 졌기 때문입니다. 이어서, 순수한 미세아교세포는 혼합된 신경교세포(14,15)의 상이한 접착성에 기초하여 단리될 수 있다. 그러나이 방법은 주산기 뇌에서 미세 아교세포를 분리 할 수 있으며 몇 주가 걸립니다. 세포 배양에서 잠재적인 변수는 분자 발현16과 같은 미세아교세포 특성에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 이러한 방법에 의해 단리된 미세아교세포는 CNS 질환의 상태를 시뮬레이션함으로써 시험관내 실험에만 참여할 수 있으며, 생체내 질환 상태에서 미세아교세포의 특성과 기능을 나타낼 수 없다. 따라서 성인 마우스 뇌에서 미세 아교세포를 분리하는 방법을 개발할 필요가 있습니다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 자기 분리는 널리 사용되는 두 가지 방법이지만 고유 한 제한 사항16,17,18,19이 있습니다. 각각의 장점과 단점은 토론 섹션에서 대조 될 것입니다. MACS 기술의 성숙은 세포를 신속하게 정화 할 수있는 가능성을 제공합니다. Huang et al.은 뇌의 탈수초성 병변을 라벨링하는 편리한 방법을 개발했습니다20. 이 두 가지 기술적 접근 방식을 결합하여 우리는 신속하고 효율적인 원주형 CD11b 자기 분리 프로토콜을 제안하여 성인 마우스 뇌에서 탈수초성 병변 주위의 미세 아교세포를 분리하고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하기위한 단계별 설명을 제공합니다. 국소 탈수초성 병변은 프로토콜 21을 시작하기 3일 전에 코퍼스 캘로섬에 2 μL의 리솔레시틴 용액 (0.9% NaCl 중1% LPC)의 입체주성 주사에 의해 야기되었다. 이 프로토콜은 시험관내 실험에서 다음 단계를 수행하기 위한 토대를 마련합니다. 또한이 프로토콜은 시간을 절약하고 다양한 실험에서 널리 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포를 분리하는 방법을 제안한다. CD11b 비드를 사용하여 포획된 미세아교세포는 높은 순도 및 생존력을 나타낸다. 프로토콜의 중요한 단계에는 초점의 정확한 국소화와 최적의 미세아교세포 정제가 포함됩니다. 프로토콜 단계 2.1에서, 병변이 정확하게 표시될…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06)의 지원을 받았다.
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
Riferimenti
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