Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

1. Voorbereiding van de collectie Identificeer een locatie om Caenorhabditis-nematoden te onderzoeken.OPMERKING: In de meeste gematigde streken kunnen C. elegans en C. briggsae gemakkelijk worden geïsoleerd uit met de mens geassocieerde habitats zoals landbouwvelden of landelijke en stedelijke tuinen1. In subtropische en tropische gebieden zijn C. briggsae, C. elegans en C. tropicalis allemaal te vinden in de hierboven genoemde met de mens geassocieerde habitats, soms in de nabijheid van elkaar. C. elegans lijkt echter de voorkeur te geven aan koelere, drogere habitats dan de andere soorten in tropische habitats7,8. Elk van de soorten kan ook worden geïsoleerd van wilde habitats die niet geassocieerd zijn met mensen, maar deze habitats worden minder vaak bemonsterd. Maak een Fulcrum-project om de verzameling en isolatie van gegevens te organiseren met de mobiele toepassingen voor gegevensverzameling. Maak online een account aan bij Fulcrum met behulp van een gratis onderwijsovereenkomst16. Voeg de toepassing Nematode Field Sampling toe aan een Fulcrum-account door op app toevoegen knop17 te klikken. Voeg de applicatie Nematode Isolation toe aan een account door op ADD APP button18 te klikken.OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat elke reis naar een locatie wordt georganiseerd als het verzamelproject met behulp van de naamgevingsconventie ‘YearMonthLocation’, bijvoorbeeld 2020februariAustralia. Voeg gebruikers toe aan het Fulcrum-account om hen toegang te geven tot het collectieproject. Zorg ervoor dat elke gebruiker de mobiele Fulcrum-applicatie downloadt om deel te nemen aan het project. Druk een set QR-codelabels af om de collecties (C-labels) en de nematode-isolaties (S-labels) te volgen met de mobiele applicatie. Bevestig de C-labels aan plastic zakken met ritssluiting, rol de gelabelde zakken in groepen van 25 en wikkel ze met een elastiekje voor verpakking. Bewaar de set S-labels voor gebruik in het laboratorium.OPMERKING: In dit protocol zijn de collecties (substraten uit het veld) opgenomen in zakken of op borden en zijn ze gelabeld met C-labels. De geïsoleerde nematoden zijn gelabeld met S-labels. De C-labels worden gebruikt om unieke collecties te identificeren en de S-labels worden gebruikt om unieke nematodenisolaten te identificeren. Deze twee soorten labels worden gebruikt om de verbinding te leggen tussen een bepaalde collectie (C-label) en de nematoden geïsoleerd uit die collectie (S-labels) in de Fulcrum-database. Print twee keer zoveel S-labels als C-labels voor een inzamelproject omdat er gemiddeld twee aaltjes per collectie worden geïsoleerd. Meer S-labels kunnen later worden afgedrukt als dat nodig is. 2.500 unieke C-labels (Supplemental File 1) en 5.000 unieke S-labels (Supplemental File 2) worden verstrekt in het supplement. Bereid 10 cm NGMA-platen voor voor verzamelingen en 3,5 cm NGMA-platen voor het isoleren van nematoden. Maak één bord van 10 cm en minstens twee platen van 3,5 cm per collectie21. Deze platen worden gezaaid met Escherichia coli stam OP50 volgens vastgestelde protocollen. Bewaar de platen voor gebruik bij 4 °C gedurende niet meer dan 1 maand. 2. Veldverzameling OPMERKING: Caenorhabditis-nematoden worden meestal geïsoleerd uit rottend plantaardig materiaal, waaronder fruit, noten, zaden, peulen, bloemen, stengels, plantaardig strooisel en compost1,5,6,8. De beste substraten zijn rot en bijna onherkenbaar als vruchten of bloemen; vermijd substraten die te droog of nat zijn (figuur 1). Substraten worden het meest efficiënt uit het veld verzameld door in paren te werken. De persoon met de contactloze infraroodthermometer selecteert een substraat voor verzameling en verzamelt het monster terwijl zijn partner de Nematode Field Sampling-applicatie in Fulcrum gebruikt om de verzamelgegevens vast te leggen. Het paar collectoren zal dit proces herhalen totdat het gewenste aantal monsters is verzameld. De lijst van materialen die nodig zijn voor veldwerk is te vinden in (Aanvullende tabel 1). Open de mobiele Fulcrum-app en selecteer Nematode Field Sampling in het vervolgkeuzemenu. Druk op + om een nieuwe record in het project te starten (figuur 2A). Maak een foto van het substraat. Klik op het vakje in het midden bovenaan om het juiste incassoproject te selecteren dat in stap 1.2 is gemaakt (figuur 2B). Tik op het veld C-label onder aan de collectierecord en kies Scannen wanneer de prompt verschijnt. Scan de streepjescode op de verzameltas met de camera van het mobiele apparaat en tik vervolgens op Gereed in de rechterbovenhoek van het scherm. Tik op het veld Substraat en selecteer een substraattype in het vervolgkeuzemenu. Voeg notities over het substraat toe door op het veld Substraatnotities te tikken en handmatig notities in te voeren. Kies een landschap in het vervolgkeuzemenu. Kies het landschap dat de bemonsteringslocatie het beste vertegenwoordigt. Kies een luchtweergave. Beschrijf bij het kiezen van het luchtbeeld de zichtbaarheid van de hemel op de bemonsteringslocatie (bijvoorbeeld een volledig uitzicht op de hemel zonder belemmerd uitzicht van bomen of andere structuren = vol). Meet de oppervlaktetemperatuur van het substraat met de contactloze thermometer en noteer de waarde in het substraattemperatuurveld.OPMERKING: Houd de contactloze thermometer niet meer dan 14 inch van het substraat terwijl u de temperatuur registreert. Meet de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid met het handheld-apparaat en neem deze gegevens op in de juiste velden.OPMERKING: Controleer of het apparaat voor omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid niet in de wacht staan. De meeteenheid verandert wanneer de knop wordt losgelaten. Houd het apparaat in een buitenzak om onregelmatige metingen te voorkomen. Sla de record op in Fulcrum door linksboven in het scherm op Opslaan te tikken. Verzamel ongeveer een eetlepel van het substraat zonder stokken of andere harde stukken door de opvangzak om te keren om deze als een “handschoen” te gebruiken om het substraat op te pakken en sluit vervolgens de zak af. Doe een papieren handdoek in de zak als het monster bijzonder vochtig is.OPMERKING: Plaats de zakken in warme klimaten in zachte koelers met koelerverpakkingen om de collecties koel te houden. Nadat alle monsters voor de dag zijn verzameld, reinigt u de verzamelapparatuur, haalt u batterijen uit sondes, laadt u batterijen op, vriest u diepvriesverpakkingen opnieuw in. Synchroniseer de Fulcrum-verzamelingsgegevens door op de knop Synchroniseren linksboven in de toepassing Nematode Field Sampling te tikken.OPMERKING: De uploads kunnen enkele minuten duren zonder een sterke mobiele verbinding, dus het is misschien het beste om te wachten op WiFi-toegang. De gegevens blijven op mobiele apparaten staan en worden gesynchroniseerd met de cloud. Verzend de monsters naar een thuisinstelling door ze ‘s nachts in een verzenddoos te plaatsen. Minimaliseer de tijd dat de monsters worden blootgesteld aan temperaturen lager dan 11 °C of meer dan 25 °C door pakketten te verzenden op dagen dat de lading wordt vervoerd.OPMERKING: De meeste verzendfaciliteiten verzenden geen lading ‘s nachts in het weekend op afgelegen locaties. 3. Uitbouwen van veldcollecties in het laboratorium OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u de overdracht van monsters van gelabelde verzamelzakken naar gelabelde platen organiseert. De monsters kunnen afkomstig zijn van een nachtelijke zending of rechtstreeks uit het veld. Ontvang de verzending van collecties en inspecteer op kapotte zakken of ander bewijs van schade. Als zakken kapot zijn, gooi het materiaal dan weg en reinig de ongebroken verzamelzakken met 70% ethanol; vermijd het C-label op de zak met de ethanol, omdat dit het etiket zal verkleuren en het moeilijk leesbaar zal maken. Noteer voor elke tas met ritssluiting het C-label op de zak en bevestig een bijpassend C-label op het deksel van een plaat van 10 cm die is gespot met OP50-bacteriën.OPMERKING: De gelabelde platen van 10 cm worden voor de rest van het protocol ‘C-platen’ genoemd. De eenvoudigste manier om de monsters te organiseren, is door de verzamelzakken op een laboratoriumbank te plaatsen met de bijpassende C-plaat erop (figuur 3). Breng voor elke verzameling ongeveer een eetlepel monster van de verzamelzak over naar de C-plaat met behulp van een schone plastic lepel. Voeg het monster rond het bacteriële gazon toe in een halve maan- of ringvorm, bedek het bacteriële gazon niet volledig (figuur 4).OPMERKING: Houd de eetlepel schoon door deze in een bekerglas van 95% ethanol te plaatsen wanneer deze niet in gebruik is. Gebruik een papieren handdoek om de eetlepel te drogen voordat u extra monsters overbrengt. Noteer de tijd dat de collecties werden overgebracht van verzamelzakken naar C-platen en bewaar de C-platen ten minste 24 uur bij kamertemperatuur (RT) voordat wordt geprobeerd nematoden in sectie 4 te isoleren. 4. Nematoden isoleren uit collecties Open de Fulcrum-applicatie op het mobiele apparaat en kies Nematode Isolation in het toepassingsmenu (Afbeelding 5A). Maak een nieuwe isolatierecord door op het pictogram + rechtsonder te tikken (afbeelding 5B). Controleer in het nieuwe isolatierecordscherm het juiste verzamelingsproject door de projectnaam aan te vinken die wordt weergegeven in het vak in het midden bovenaan. Als het verkeerde project wordt weergegeven, tikt u op de projectnaam om over te schakelen naar het juiste project (afbeelding 5C). Tik op de knop Selecteren onder het veld C-label om het C-label te vinden dat is gekoppeld aan het monster waaruit nematoden worden geïsoleerd (figuur 5D). Tik op het pictogram Zoeken en tik vervolgens op het pictogram Scannen om de QR-code met C-label op de C-plaat met de camera van het apparaat te scannen. Zodra de QR-code is gescand, verschijnt er een C-labelrecord in het C-labelveld . Tik op het camerapictogram in het veld Foto’s om de camera van het apparaat te openen en gebruik deze om een foto te maken van het monster op de C-plaat met de QR-code zichtbaar (figuur 5E). Tik op Gereed om terug te keren naar het isolatiescherm.OPMERKING: Deze isolatierecordfoto’s kunnen worden gebruikt om specifieke kenmerken van het substraat op een later tijdstip te verkennen. Gebruik een ontleedmicroscoop om te zoeken naar nematoden op de C-plaat. Tik op het veld Wormen op Monster om de aanwezigheid van nematoden op het monster te registreren (figuur 5F). Tik op Ja als er nematoden op de C-plaat aanwezig zijn en tik op Nee als er geen aaltjes aanwezig zijn. Tik op Tracks als alleen nematode tracks aanwezig zijn. Als er geen nematoden aanwezig zijn, parafilm dan de C-plaat en gooi deze weg in een biohazard bak.OPMERKING: Keer de C-plaat om over de biohazard afvalbak en tik zachtjes op de achterkant van de plaat om alle bemonsterde substraten los te maken. Deze stap maakt het gemakkelijker om nematoden te vinden en te isoleren die zich onder het substraat op de C-plaat kunnen bevinden. Als er nematoden aanwezig zijn, isoleer dan maximaal vijf nematoden uit de C-plaat. Om een nematode te isoleren, brengt u één nematode over van de C-plaat naar een S-plaat met behulp van een platina draadprikker. Isoleer gezonde, gravid volwassenen indien mogelijk. Isoleer echter andere stadia als volwassenen niet worden gevonden.OPMERKING: Na isolatie hebben maximaal vijf S-platen elk een enkele nematode erop. Houd deze S-plaat(s) met geïsoleerde nematoden van dezelfde C-plaat samen georganiseerd in een nette stapel uit de buurt van andere S-platen totdat ze in Fulcrum worden ingevoerd. Tik op het veld S-gelabelde platen om de S-plaat(s) in te voeren die voor deze isolatie worden gebruikt. Tik op de + in de rechterbenedenhoek. Tik op S-label en klik vervolgens op Scannen om de camera van het apparaat te openen. Gebruik de camera van het apparaat om de QR-code van het S-label op de S-plaat te scannen.OPMERKING: Zorg ervoor dat de S-labelcode overeenkomt met de code op de plaat. Als het overeenkomt, tikt u op Gereed. Als dit niet het geval is, tikt u op Annuleren en opnieuw scannen totdat het overeenkomt en klikt u vervolgens op Gereed. Soms worden QR-codes van nabijgelegen platen per ongeluk gescand. Nadat u elke S-plaat hebt ingevoerd, slaat u het item op met de knop Opslaan in de rechterbovenhoek. De inzending gaat verloren als deze niet wordt opgeslagen. Tik op de + in de rechterbenedenhoek om indien nodig meer S-gelabelde platen toe te voegen totdat alle nematoden geïsoleerd uit de C-plaat zijn ingevoerd. Nadat u alle S-gelabelde platen voor de isolatierecord hebt toegevoegd, tikt u op de knop < linksboven om terug te gaan naar het isolatie-opnamescherm.OPMERKING: Als u een isolatierecord wilt annuleren omdat fouten niet kunnen worden opgelost, klikt u linksboven op Annuleren . Met deze stap wordt een dialoogvenster geopend waarin wordt gevraagd of de record kan worden verwijderd zonder op te slaan. Klik desgewenst op Ja, Weggooien. Tik op de knop Opslaan in de rechterbovenhoek zodra alle informatie correct is toegevoegd aan het isolatierecord. Vervolgens parafilm je de S-platen met geïsoleerde nematoden en zet ze apart in een gebied dat is aangewezen om S-platen met nematoden te houden. Parafilm de C-plaat en gooi deze weg in de biohazard bak. Tik op het pictogram Synchroniseren om alle gegevens naar Fulcrum te uploaden. Sorteer alle S-platen in alfanumerieke volgorde en plaats de S-platen in kartonnen dozen. Zorg ervoor dat de S-platen met de dekselzijde naar beneden en geparafilmd zijn. Stapel maximaal vier S-platen op één positie in de doos en label de kartonnen doos met de projectnaam, datum, tijd en een uniek doosnummer. Bewaar de gelabelde dozen bij RT. Deze isolaten worden gecontroleerd op proliferatie om 48 uur en opnieuw om 168 uur indien nodig. 5. S-platen exporteren vanuit Fulcrum OPMERKING: In deze sectie wordt beschreven hoe u S-labels die worden gebruikt in het isolatieproces kunt exporteren uit de Fulcrum-projectdatabase. Deze S-labels zullen worden gebruikt om prolifererende isofemalelijnen te volgen terwijl ze worden geïdentificeerd door sequentie-identiteit in secties 6-9. Meld u aan bij de Fulcrum-website en selecteer de toepassing Nematode Isolation . Klik op Exporteren aan de linkerkant van het scherm. Klik hierop om het gewenste project te selecteren en schakel het selectievakje Nematode Isolation in. Klik op Volgende om een .zip bestand te downloaden dat het bestand ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ bevat. Open het bestand ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ en sorteer het op de kolom ‘S-label’ in oplopende volgorde (het kleinste S-label staat bovenaan). Selecteer alle S-labels en kopieer ze uit de spreadsheet. Navigeer met een webbrowser naar de wild isolaat genotypering sjabloon google sheet (wild_isolate_genotyping_template). Maak een kopie van dit Google-blad door met de rechtermuisknop op het tabblad Genotypering-sjabloon te klikken en vervolgens de optie Kopiëren naar nieuwe spreadsheet te selecteren. Selecteer Spreadsheet openen om het nieuwe Google-werkblad weer te geven. Geef dit nieuwe blad de naam van het steunpuntproject gevolgd door ‘wild_isolate_genotyping’, bijvoorbeeld ‘2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping’.OPMERKING: Dit blad wordt in de rest van het protocol het ‘genotyperingsblad’ genoemd. Plak de gekopieerde S-labels uit de kolom ‘nematode_isolation_s_labeled_plates.csv’ ‘s_label’ in de genotyperingskolom met de titel ‘s_label’. Controleer de kolom ‘s_label_repeat_error’ voor ‘1’s. Een waarde van ‘1’ in deze kolom betekent dat het S-label ergens op het genotyperingsvel wordt gedupliceerd. Als er doublures worden ontdekt, onderzoek en corrigeer ze dan voordat u verder gaat. Vul de kolom ‘isolation_box_number’ van het genotyperingsblad in voor alle S-labels. 6. Controleer op proliferatie op S-platen Controleer op prolifererende dieren op S-platen 48 uur na isolatie (gebruik de datum en tijd van de laatste isolatie op de doos uit stap 4.11 om de timing te begeleiden).OPMERKING: Prolifererende nematoden worden gekenmerkt door nakomelingen op de S-plaat. Als een S-plaat woekert, voert u ‘1’ in de kolom proliferation_48 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label ’48 h proliferatie, vak 1′. Plaats maximaal 88 S-platen in een proliferatiedoos en begin vervolgens met het vullen van een nieuwe doos met het label ’48 h proliferatie, doos 2′. Zorg ervoor dat de S-labels in alfanumerieke volgorde zijn georganiseerd in de 48 h-proliferatievakken.OPMERKING: Gooi de niet-prolifererende S-platen niet weg; deze platen worden om 168 uur na isolatie opnieuw gecontroleerd. Consolideer deze S-platen desgewenst in numerieke volgorde in vakjes met het label ’48 h niet-prolifererend, vak X’, maar vergeet niet te noteren wanneer de 168 h-controle op het nieuwe vak moet plaatsvinden. Na het identificeren van alle prolifererende S-labels na 48 h, ga je verder met sectie 7 voor S-platen met proliferatie na 48 h. Controleer de S-platen die niet woekeren bij 48 uur na isolatie opnieuw bij 168 uur na isolatie. Als een S-plaat zich nu verspreidt, voert u ‘1’ in de kolom proliferation_168 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label ‘168 h proliferatie, vak 1’. Plaats maximaal 88 S-platen in een proliferatiedoos en begin vervolgens met het vullen van een nieuwe doos met het label ‘168 h proliferatie, doos 2’. Zorg ervoor dat u S-labels in alfanumerieke volgorde ordent in de 168 h proliferatievakken. Gooi de S-platen weg die na 168 uur geen proliferatie hebben. Ga verder naar sectie 7 voor S-platen met proliferatie bij 168 h. 7. Lysis van isomellijnen OPMERKING: Deze stap gebruikt de gegevensfiltertool in Google Sheets om lysis-werkbladen voor de S-platen in de proliferatievakken af te drukken. Het doel van de lysis werkbladen is om personeel te voorzien van de juiste posities voor S-labels in lysis strip buizen op de bank. Open het genotyperingsblad voor het gewenste project en selecteer alle cellen door Cmd+A te typen. Klik op Gegevens > Een filter maken om een filterknop toe te voegen aan elke kolomkop. Gebruik de filterknoppen om alleen de S-platen weer te geven die worden gegenotypeerd. Als bijvoorbeeld alle S-platen met proliferatie bij 48 uur moeten worden gelyseerd: Klik op de filterknop in de kolom ‘proliferation_48’ en selecteer ‘1’. Zodra het genotypering google sheet is gefilterd, bekijkt u de lijst met weergegeven S-labels om er zeker van te zijn dat dit de S-labels zijn die op het werkblad moeten worden afgedrukt. Voer in de kolom ‘strip_tube_number’ van het google-blad voor genotypering elke 11 rijen een uniek nummer in. Voer de stripbuisnummers voor een project in opeenvolgende volgorde in, beginnend bij 1 en nooit gedupliceerd. Voer in de ‘strip_tube_position’ 2 tot en met 12 in voor elk stripbuisnummer.OPMERKING: Gebruik 12-buiss stripbuizen voor lysis. De eerste positie (strip_tube_position 1) is controle, maar de besturingselementen worden niet toegevoegd aan de lysis-werkbladen (alleen de strip_tube_positions worden toegevoegd, 2-12). Op het moment van lysis wordt de positieve controlestam ‘N2’ als positieve controle toegevoegd aan positie 1 van elke even genummerde stripbuis. Er worden geen wormen toegevoegd aan positie 1 van elke oneven genummerde stripbuis als negatieve controle. Filter het genotypering google sheet verder om alleen de S-labels op te nemen in één te lyseren proliferatievak en selecteer vervolgens de kolommen ‘s_label’ tot en met ‘lysis_notes’. Druk een lysis-werkblad af voor elke proliferatiedoos die moet worden gelyseerd. Klik op het vervolgkeuzemenu in het veld Afdrukken en selecteer Geselecteerde cellen. Klik op Volgende in de rechterbovenhoek en gebruik vervolgens het dialoogvenster om het lysis-werkblad voor het proliferatievak af te drukken. Herhaal stap 7.3-7.5 om een lysis-werkblad af te drukken voor elk proliferatievak.OPMERKING: Elke proliferatiedoos bevat maximaal 88 S-platen, wat overeenkomt met acht 12-well stripbuizen. Bereid 12-well stripbuizen voor voor alle monsters die zullen worden gelyseerd. Label een stripbuis met een unieke ‘strip_tube_number’ toegewezen in het lysis werkblad. Dit etiket moet op de dopstrook en de stripbuis worden geschreven om verwarring te voorkomen als ze gescheiden zijn. De EVEN stripbuizen hebben een positieve controle (N2 wormen) in positie 1. De ODD stripbuizen hebben een negatieve controle (geen wormen) in positie 1. Vul voldoende lysisbuffer aan (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatine met proteïnase K toegevoegd aan een eindconcentratie van 0,4 mg/ml) voor alle monsters en voeg 5% extra toe voor pipetfouten. Schaal indien nodig.OPMERKING: De lysisbuffer kan het beste worden bereid door alle ingrediënten behalve proteïnase K te combineren en in te vriezen in 10-50 ml aliquots bij -20 °C. Ontdooi aliquots en houd ze vóór gebruik op 4 °C; voeg vlak voor gebruik proteïnase K toe en meng grondig. Houd de lysisbuffer op ijs tijdens het werken. Rangschik de S-platen voor een bepaalde stripbuis in volgorde met behulp van het afgedrukte lysis-werkblad als leidraad. Maak een stripbuis los en voeg 8 μL lysisbuffer toe aan elke dop met een repeatpipettor. Voeg de lysisbuffer toe aan één strook doppen tegelijk, omdat de lysisbuffer zal verdampen als deze bij RT wordt achtergelaten en onbedekt wordt gelaten. Kies 3-5 dieren van de bronplaten (S-plaat of N2-voorraadplaat voor positieve controles) in de juiste dopposities die op het lysis-werkblad worden aangegeven. Noteer notities voor elke S-plaat met minder dan 5 wormen die naar de lysis zijn geplukt in het gedeelte lysis_notes van het lysis-werkblad. Nadat u nematoden in elke positie van de stripbuis hebt geladen, plaatst u de dopstrook terug op de stripbuis. Stem de gemarkeerde dop (positie 1) af op de gemarkeerde buis (positie 1). Eenmaal afgedekt, centrifugeer de stripbuis kort totdat de nematoden zich op de bodem van de buis bevinden. Plaats de strip in de -80 °C vriezer tot deze volledig bevroren is (minimaal 10 min). Herhaal stap 7.9 tot en met 7.11 totdat aan alle strips nematoden zijn toegevoegd voor lysis. Organiseer de buisstrips in numerieke volgorde. Verwijder de sets stripbuizen en voer het lysisprogramma uit in een thermocycler: 1 uur bij 60 °C, 15 min bij 95 °C, vasthouden bij 12 °C. Wanneer het lysisprogramma is voltooid, draait u de monsters op 300 x g gedurende 15 s bij RT en bewaart u de lysaten bij -80 °C gedurende maximaal 1 week. Organiseer de buisstrips in numerieke volgorde met behulp van 96-well plaathouders en voeg een label toe met een proliferatiedoosnummer, stripbuisnummerbereik, datum en de initialen van de onderzoeker. Werk de genotyperingsbladkolommen ‘lysis_date’ en ‘lysis_notes’ bij met informatie uit het lysis-werkblad. 8. PCR van SSU- en ITS2-sequenties OPMERKING: In dit gedeelte vindt u instructies voor het uitvoeren van twee afzonderlijke PCR’s voor elke gelyseerde S-plaat. De eerste primerset versterkt een 500-bp fragment van het 18S rDNA small subunit gene (SSU); oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA 12. Deze PCR wordt gebruikt om de kwaliteit van het template DNA te controleren. De PCR versterkt het SSU-gebied voor bijna alle nematodensoorten. Als de SSU PCR niet versterkt, suggereert dit resultaat dat de lysiskwaliteit slecht is en de lysis moet worden herhaald voor deze S-plaat. De tweede primerset versterkt een 2.000 bp-fragment van het interne getranscribeerde spacergebied tussen de 5,8S- en 28S-rDNA-genen (ITS2); oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. Het ITS2 PCR-product is Sanger gesequenced en de sequentie wordt gebruikt om nematoden in het geslacht Caenorhabditis te identificeren tot het soortniveau door sequentieovereenkomst. Gebruik het filtergereedschap in het genotyperingsblad om alleen de S-labels weer te geven die voor PCR moeten worden gebruikt. Werk de pcr_plate_number bij en pcr_well kolommen in het genotyperingsblad. Om degradatie van lysismateriaal te voorkomen, worden de SSU en ITS2 PCR’s tegelijkertijd uitgevoerd. Gebruik dezelfde pcr_plate_number voor de ITS2- en SSU-PCR’s, ook al zijn dit afzonderlijke reacties in afzonderlijke platen. Ze worden onderscheiden met ‘SSU’- of ‘ITS2’-labels. Wijs een pcr_plate_number toe aan acht of minder stripbuizen (één stripbuis per rij van de 96-well PCR-plaat, gerangschikt in oplopende volgorde, bijvoorbeeld het laagste stripbuisnummer bovenop). Wijs vervolgens een pcr_plate_well toe aan elk S-label in de stripbuizen.OPMERKING: De bandbuizen zijn in oplopende volgorde gerangschikt, waarbij het laagste bandbuisnummer is toegewezen aan rij A en het hoogste nummer in rij H. Positie 1 van alle bandbuizen is toegewezen aan kolom 1. Daarom wordt stripbuis nummer 1, positie 1 toegewezen aan PCR-plaatnummer 1, nou ja A01. Label 96-well PCR-plaat(s) voor de monsters die voor PCR zullen worden gebruikt. Label elke PCR-plaat met de volgende informatie: projectnaam, PCR-type, PCR-kenteken en datum van PCR (bijvoorbeeld 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Label ook de plaat met de stripbuisnummers die in elke rij worden geladen. Haal het lysismateriaal uit de -80 °C vriezer en ontdooi de stripbuizen met het lysismateriaal op ijs. Terwijl het lysismateriaal ontdooit, bereidt u ITS2- en SSU-mastermixen in afzonderlijke buizen op ijs. De SSU- en ITS2 PCR-recepten zijn te vinden in aanvullende tabel 2.OPMERKING: Bereid 100 reacties van PCR-mastermix voor elke 96-well plaat om een pipetteerfout mogelijk te maken. Gebruik een conisch mengsel van 15 ml of 50 ml om de mastermix vast te houden als er grote volumes moeten worden gebruikt. Vortex de mastermix voorzichtig tot Taq over het mengsel is verdeeld. Eenmaal gemengd, aliquot 38 μL van het mastermengsel in de juiste putten van de PCR-platen op ijs. Gebruik steriele v-bodemgoten voor eenmalig gebruik en een 12-well meerkanaals pipet om de mastermix over te brengen naar de PCR-platen. Draai de ontdooide lysisstripbuizen naar beneden om lysismateriaal van de doppen te verwijderen. Verwijder voorzichtig de deksels van alle stripbuizen die in de eerste PCR-plaat worden geladen. Gebruik een meerkanaals pipet met een laag volume (12-well of 8-well) om 2 μL lysaat toe te voegen aan de juiste put in de PCR-plaat. Pipetteer het lysaat eenmaal op en neer voordat u de 2 μL verwijdert.OPMERKING: Controleer de tips om er zeker van te zijn dat ze de lysis bevatten voor de overdracht. Vergeet niet om tips tussen rijen of kolommen te wijzigen. Bedek de PCR-plaat met PCR-lijmfolie en gebruik een roller om een strakke afdichting te creëren. Nadat de folie is aangebracht, draait u de PCR-platen kort in een centrifuge. Houd de plaat op ijs totdat deze klaar is om in de thermocycler te lopen. Voer de PCR’s uit met het juiste thermocycler-programma. Raadpleeg aanvullende tabel 2 voor de details van de SSU- en ITS2 PCR-programma’s. Herhaal stap 8.4- 8.8 totdat alle PCR’s zijn uitgevoerd. Terwijl de PCR-reacties lopen, giet u een 100 ml 1,5% agarose-gel. Elke gel bevat monsters of een enkele PCR-plaat. Voeg 1,5 g agarose toe aan een kolf van 500 ml, voeg vervolgens 100 ml 1x TAE-buffer toe (aanvullende tabel 3) en draai om te mengen. Magnetron om de gel op te lossen en af te koelen. Zodra de oplossing is afgekoeld, voegt u 5 μL ethidiumbromideoplossing van 10 mg/ml toe en mengt u om te combineren. Giet de oplossing in een gietbak met vier 25-well kammen, zodat de gel plaats biedt aan 96 monsters plus een ladder voor elke rij in de gel.OPMERKING: Ethidiumbromide is een krachtig mutageen. Gebruik bij het hanteren van ethidiumbromide een laboratoriumjas, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische veiligheidsbril. Vlak voordat de PCR klaar is, voegt u 6x ladende kleurstof toe aan een wegwerptrog en gebruikt u een meerkanaals pipet om 2 μL 6x ladende kleurstof toe te voegen aan elke put van een nieuwe 96-well PCR-plaat. Deze plaat wordt gebruikt om de monsters in de gel te laden. Maak genoeg van deze platen om alle monsters te huisvesten. Wanneer de PCR’s klaar zijn, verwijdert u de PCR-platen en centrifugeert u ze kort op 300 x g gedurende 15 s bij RT. Bewaar de PCR-platen op ijs totdat de PCR-producten op een gel kunnen worden uitgevoerd. Om de producten op een gel uit te voeren, gebruikt u een 12-well meerkanaals pipet om 5 μL van elk monster toe te voegen aan de juiste put van een 96-well plaat met 2 μL 6x ladende kleurstof. Laad vervolgens 6 μL van dit mengsel in elke put van een recent gegoten gel. Laad 6 μL van 1 KB plus ladder in de eerste put van elke rij van de gel.OPMERKING: Om de putjes van de gel te vullen, kan het nodig zijn om rij A en rij B van de PCR-plaat in de eerste rij van de gel af te wisselen. Om verwarring te voorkomen, neemt u de gel_number en gel_position op in het genotyperingsblad voor elk PCR-monster. Plaats een nieuw foliedeksel op de resterende PCR in de plaat(en) en bewaar deze bij 4 °C. Deze reactieproducten zullen worden gebruikt voor sequencing in stap 9. Laat de PCR-producten gedurende 20 minuten op de gel op 120 V lopen. Stel de gel voor en noteer welke S-labels ITS2- en/of SSU PCR-producten opleveren in de kolommen ‘pcr_product_its2’ en ‘prc_product_ssu’ van het genotyperingsvel. Markeer de aanwezigheid van een band met een ‘1’; markeer een ‘0’ voor geen enkele band. 9. Nematoden identificeren met Sanger sequencing en sequence BLAST OPMERKING: Deze sectie bevat instructies voor het sequentiëren van de ITS2-amplicons van de S-labels, het uitlijnen van die sequenties met behulp van het BLAST-algoritme en het parseren van de BLAST-resultaten om de nematoden op de S-platen te identificeren. Gebruik voor elk monster dat ITS2-positief is, het resterende ITS2 PCR-product voor Sanger-sequencing met behulp van de voorwaartse primer oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Zorg ervoor dat de sequencing-uitvoerbestanden eenvoudig aan een S-label kunnen worden gekoppeld door de kolommen ‘sequencing_plate’ en ‘sequencing_well’ van elk S-label in het genotyperingsblad op te nemen. Haal de .seq-uitvoerbestanden voor elk S-label op van het sequencingplatform. Rangschik de SEQ-bestanden voor een project in één map met .seq-bestanden voor elke batch sequencing in submappen. Open het opdrachtregelinterfacegereedschap en navigeer naar de bovenste map met de .seq-bestanden door het commando in te voeren: cd . Als het nog niet bestaat, maak dan een samengevoegde FASTA voor alle .seq-bestanden door het volgende commando in te voeren: voor dir in */; doe cd $dir; voor bestand in *.seq; echo “>”$file; cat $file; klaar >>.. /all_seqs.fa; cd ..; klaar.OPMERKING: Deze code maakt een samengevoegd FASTA-bestand met de naam ‘all_seqs.fa’ van alle .seq-bestanden in de projectmap. Dit bestand kan worden gebruikt in de NCBI online nucleotide BLAST-tool om de ITS2-sequentie van elk S-label snel uit te lijnen met de sequentiedatabase van NCBI. Navigeer in een webbrowser naar de NBCI BLAST-website20 en klik op de knop Bestand kiezen. Selecteer het all_seqs.fa-bestand dat zojuist is gemaakt en klik vervolgens op de knop Enigszins vergelijkbare reeksen (BLASTn). Klik op de BLAST-knop onderaan de pagina om de BLAST-zoekopdracht te starten. Werk het genotyperingsblad bij met de BLAST-resultaten voor elk S-label. Gebruik de filtertool om het bijwerken van het google-blad met genotypering gemakkelijker te maken. Klik op Gegevens > Een filter maken om een filterknop toe te voegen aan elke kolomkop. Filter de kolom sequencing_plate om de sequencingplaten te selecteren die moeten worden bijgewerkt met BLAST-resultaten. Gebruik het vervolgkeuzemenu op de NCBI BLAST-resultatenpagina om de resultaten voor elke ITS2-reeks van de S-plaat te controleren (figuur 6). Controleer of er geen BLAST-hits zijn. Een reeks-ID in de vervolgkeuzelijst met het voorvoegsel * heeft geen blast hits. Voer voor deze S-labels ‘no hit ‘ in de kolom manual_blast_notes van het genotyperingsblad in. Controleer op een mogelijke nieuwe Caenorhabditis-soort . Klik op de link op de bovenste treffer om de uitlijning te visualiseren (figuur 6). Als de tophit (1) een Caenorhabditis-soort is, (2) de uitlijning meer dan vijf mismatches in het midden van de reeks bevat en (3) de querydekking groter is dan 50%, suggereert dit resultaat dat het isolaat een nieuwe Caenorhabditis-soort kan zijn (figuur 7). Voor deze S-platen invoeren, de soort van de bovenste BLAST hit in de kolom ‘species_id’, voer een 1 in de kolom ‘possible_new_caeno_sp’, en ‘mogelijk nieuwe Caeno sp.’ in de kolom ‘manual_blast_notes’ samen met procent identiteit, (bijvoorbeeld ‘mogelijk nieuwe Caeno sp. 89% identiteit’). Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een Caenorhabditis-soort , voert u de volledige geslachts- en soortnaam van de top BLAST-hit in de kolom ‘species_id’ in. Bijvoorbeeld ‘Caenorhabditis elegans’. Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een niet-Caenorhabditis-soort , voer alleen het geslacht van de bovenste BLAST-hit gevolgd door ‘sp.’ in de kolom ‘species_id’ in. Deze notatie betekent dat het isolaat een onbekende soort is binnen het benoemde geslacht. Bijvoorbeeld ‘Oscheius sp.’.OPMERKING: De ITS2-sequentie kan niet worden gebruikt om isolaten betrouwbaar te identificeren tot het soortniveau buiten het geslacht Caenorhabditis3,13. Vermeld 1 in de kolom ‘make_strain_name’ van het genotyperingsblad als ‘species_id’ = ‘Caenorhabditis elegans’, ‘Caenorhabditis briggsae’, of ‘Caenorhabditis tropicalis’, OF ‘possible_new_caeno_sp’ = 1. Noem de stammen met unieke namen volgens de nomenclatuurconventies van Caenorhabditis , d.w.z. een unieke laboratoriumaanduiding bestaande uit 2-3 hoofdletters gevolgd door een nummer voor elke unieke stam23. Voer de stamnamen in de kolom ‘strain_name’ in. Nadat stammen zijn benoemd, kunnen ze worden gecryopreserveerd met behulp van vastgestelde protocollen 24. 10. Verwerking van de verzamelgegevens met het easyFulcrum-pakket in R OPMERKING: In deze stap wordt beschreven hoe u de verzamelingsgegevens (C-labels) en de isolatiegegevens van de nematoden (S-labels) aan elkaar koppelt met behulp van het pakket easyFulcrum R. De software bevat functies die de Fulcrum-gegevens verder verbinden met de genotyperingsgegevens van het genotyperingsblad, zodat S-label species-identiteiten en stamnamen in één gegevensframe worden georganiseerd. Maak een nieuwe map met de naam voor het collectieproject. Rangschik de mappenstructuur in de map om te voldoen aan de vereisten die worden beschreven in het R-pakket easyFulcrum15. Navigeer naar de Fulcrum-website en meld u aan. Exporteer de onbewerkte projectgegevens uit de Fulcrum-database met behulp van de gegevensexporttool van de Fulcrum-website aan de linkerkant en selecteer de volgende selectievakjes: project, inclusief foto’s, inclusief GPS-gegevens, veldbemonstering en isolatie.OPMERKING: De Fulcrum-gegevens voor het project worden geëxporteerd als vijf bestanden met een door komma’s gescheiden waarde (.csv). De volledige projectgegevens worden samengevoegd tot één gegevensframe met behulp van het easyFulcrum-pakket in R. Verplaats de vijf .csv bestanden die vanuit Fulcrum zijn geëxporteerd naar de projectmap die in stap 10.1 is gemaakt, zoals aangegeven in het easyFulcrum-vignet21. Open een Rstudio-sessie en installeer het easyfulcrum-pakket in R door de volgende opdrachten in te voeren in de R-console ‘install.packages(“devtools”)’ en ‘devtools::install_github(“AndersenLab/easyfulcrum”)’. Open een nieuw R-script en volg de aanwijzingen in het easyfulcrum-vignet om de verzamelgegevens te verwerken21.