一种由工程成纤维细胞生长因子1刺激的Descemet剥离的人类角膜器官培养模型，仅具有加速愈合

这项工作使用现有标本，没有确定受试者，并且根据45 CFR 46.101（b）（4）（4）免于IRB批准。 人类供体角膜是从美国各地的不同眼库获得的（见 材料表）。眼库根据镜面评估后的牙龈、多形性、多角膜增多症和/或低 ECD 等发现，分别对角膜进行营养不良性评价。 图1 显示了在伤口形成期间，剥离后立即和培养2周后角膜中的台盼蓝染色。 图1：代表伤口形成期间，剥离后立即以及培养14天后的角膜的图表，如台盼蓝可视化的那样。 测量这些时间点之间染色面积的减少以确定愈合水平。 请点击此处查看此图的大图。 1. 伤口形成 使用无菌镊子，从培养基中取出角膜，并用1x PBS冲洗以除去残留的培养基和细胞碎片。冲洗后，将角膜内皮面朝上放在培养皿的盖子上。 将30μL台盼蓝移液到孔中。在台盼蓝中浸入新的4毫米活检拳，然后轻拍任何多余的。 用双手将冲头放在角膜中心上方，并将其直接降低到内皮表面上，施加最小的压力。 在不改变角膜上的位置或压力的情况下，将拳头转移到一只手上，并用新释放的手伸手镊子。使用镊子将角膜固定到位，同时轻轻地来回扭动活检拳约90°几次。 将拳头从角膜上直接抬起，放在一边。 在1x PBS中再次冲洗，以去除多余的台盼蓝。 2. 脱模 将培养皿盖上的角膜转移到解剖范围。注意：不要让角膜干燥超过5分钟。如果需要更多的时间来完成该过程，请在1x PBS中再次冲洗以重新水化内皮。 用弯曲的镊子将角膜固定到位，沿着活检拳留下的台盼蓝环轻轻拖动尖锐的30 G针尖，对Descemet的膜进行评分。使用最小的压力，以避免破坏潜在的基质。 使用Sinskey钩，使用轻柔的舀取动作来抬起并剥离Descemet在伤口边缘周围的膜，朝着病变的中心工作。注意：Descemet的膜应该具有非常小的阻力。如果遇到困难，可能会拉起基质。如果发生这种情况，请重新开始，从伤口边缘的新点抬起。 一旦Descemet的大部分膜与基质分离，使用Gorovoy镊子去除膜并放在一边。 检查剥离区域是否有任何剩余的膜片，并用Gorovoy镊子去除。 3. 台盼蓝染色 注意：在Descemet剥离后，用台盼蓝染色角膜以可视化伤口区域。 将培养皿盖上的角膜放回生物安全柜中，并在含有0.01%（w / v）CaCl 2和MgCl 2的1x PBS中冲洗，以去除细胞碎片并促进剩余CEC与完整的Descemet膜紧密粘附。 将角膜放入孔室中，并将30μL台盼蓝移液到内皮层上30秒。 使用镊子轻轻摇晃角膜，以确保整个内皮表面被覆盖。 用0.01%（w / v）CaCl 2和MgCl2 在1x PBS中冲洗掉多余的台盼蓝，并在 解剖显微镜下对染色的角膜进行成像，用于第0天的时间点。 确保角膜是平衡的，以便光线在整个时间点均匀传输，并且定位可以跨时间点复制。注意：如果需要，镊子可用于在成像时将角膜固定到位。 4. 文化时期 在含有由OptiMEM组成的低血清培养基的六孔板中培养角膜;1x胰岛素，转铁蛋白和硒;1x抗生素/抗真菌药;0.02毫克/毫升氯化钙2;0.2毫克/毫升抗坏血酸;和0.8%热灭活胎牛血清。在仅 8 mL 低血清培养基中培养左角膜，在 8 mL 低血清培养基中培养右角膜，补充 100 ng/mL eFGF1 （NM141）。 在37°C下用6%CO2 孵育14天，每日更换培养基。 在第3天，第6天，第9天，第12天和第14天重复台盼蓝染色程序，并在染色后立即对每个角膜进行成像。请务必在所有时间点保持相机设置的一致性。 在第12天，向对照和eFGF1（NM141）补充的培养基中加入10μM EdU，并孵育48小时以标记增殖细胞。在第 13 天再次使用 EdU 续订媒体。 在第14天，像往常一样加入EdU，台盼染色和成像角膜后48小时，除了使用1x PBS与CaCl2 和MgCl2代替1x PBS外，使用普通的1x PBS进行冲洗，以防止钙与茜素红染色相互作用。 5. 茜素红染色 在第14天，在0.9%盐水溶液中制备5%茜素红。注意：茜素红不会完全溶解在盐水溶液中。结合后，涡旋溶液和岩石至少1小时。再次涡旋，并在使用前过滤以去除未溶解的颗粒。 一旦台盼染色和成像完成，将角膜转移到出孔的培养皿中，并将200μL茜素红添加到每个角膜的内皮表面。 染色2分钟，然后在1x PBS的培养皿中冲洗每个角膜以除去多余的茜素红，然后放入预先填充有8mL 1x PBS的六孔板中洗涤两次5分钟。 第二次洗涤后，在解剖显微镜下对每个角膜的剥离区域进行成像。注意：与台盼成像不同，角膜可以留在1x PBS中对茜素染色进行成像，以防止它们在此过程中变干。 6. 固定和渗透 捕获茜素图像后，将角膜转移到12孔板上，并在4mL含有0.05%吐温-20（PBS-T）的1x PBS中洗涤30分钟，以在固定前从组织中除去任何颗粒。 在室温下将角膜固定在4 mL 4%PFA中30分钟。 在含有1%Triton X-100的4mL 1x PBS中透化细胞5分钟，然后在4mL普通1x PBS中洗涤三次，每次30分钟。 7. 免疫组织化学 在37°C下在含有2%牛血清白蛋白和2%山羊血清的1x PBS中阻断角膜1小时。 在含有2.5μg/ mL一抗小鼠抗ZO-1的1mL封闭溶液中孵育1小时，在37°C下1小时，然后在4mL 1x PBS中洗涤三次，每次30分钟。注意：在抗体染色过程中，板可以倾斜，以最大限度地减少所需试剂的体积。只需确保整个角膜完全浸没在抗体溶液中即可。 使用含有0.88 mg / mL抗坏血酸，0.26 mg / mL CuSO 4和2.5 μM Alexa Fluor488叠氮化物的鸡尾酒进行EdU Click-iT反应。 制备反应组分 加入500μL1x PBS至88mg抗坏血酸并涡旋直至溶解。 向44mgCuSO 4 中加入840μL去离子水并涡旋至溶解。 通过 按此顺序将以下试剂加入6 mL 1x PBS中来制备鸡尾酒，每次加入后倒置管进行混合：30μL抗坏血酸溶液，30μL CuSO4 溶液，然后是15μLAlexa Fluor 488注意：一旦制备，该溶液对光敏感。对于方案的其余部分，应尽可能保护角膜免受光照。 向每个角膜中加入1mLEdU反应混合物，并在室温下反应1小时。 向每个角膜中加入4 mL 10μg/ mL Hoechst 33342，并在室温下反应2分钟，然后在1x PBS-T中洗涤三次，每次30分钟。 在含有2μg/ mLAlexa Fluor 555标记的山羊抗小鼠IgG的1mL封闭溶液中孵育1小时，然后在1x PBS-T中洗涤三次，每次30分钟。 将角膜在4°C下储存在4毫升1x PBS中，其中含有1%抗/抗，0.1%环丙沙星和0.1%两性霉素B，以防止微生物生长。 进行共聚焦成像时，将整个角膜安装在200μL安装介质中，放在载玻片上，盖玻片向下贴平。 8. 台盼图像分析 使用NIH的开源软件ImageJ执行所有图像分析。使用 “文件”>“打开”打开 图像，然后单击“ 图像”>“调整>颜色阈值”。 使用“Hue”滑块仅包含蓝色范围，并将上方的“亮度”滑块一直向左调整以包括更多染色区域。注意：如果此操作导致图像中未沾染的台盼表部分被包括在内，则“亮度”滑块可以返回到其原始级别。 慢慢调整上面的“饱和度”滑块，直到阈值准确勾勒出染色区域的轮廓。注意：在此过程中打开原始图像的副本以供参考会很有帮助。 单击颜色阈值菜单中的 “选择 ”按钮，然后使用选择画笔工具取消选择伤口外拾取的区域。 单击“ 分析>测量” 以像素为单位报告染色区域。 使用 “编辑>选择”>“选择”取消选择 所有内容，并使用椭圆形选择工具尽可能紧密地适合边缘，然后单击“ 分析>测量 ”以像素为单位报告角膜面积。注意：如果图像的这一部分太暗，可以暂时调高亮度，以帮助可视化边缘。 记录面积值并将染色面积除以整个角膜的面积，然后乘以100以计算染色的百分比。 对每个图像重复此过程两次，然后取三个测量值的平均值。 9. 统计分析 分析完所有图像后，将第14天染色的平均百分比除以第0天染色的百分比，以确定残留的未愈合区域。从100%中减去此量，以计算14天内剥离区域愈合的百分比。 使用配对 t 检验比较对照组和治疗组之间的愈合百分比值。